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文档简介

实验五

宫颈癌HeLa细胞株培养三、细胞传代培养一、实验目的熟练掌握细胞传代培养的操作方法。观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。二、实验原理贴壁细胞指的是体外培养条件下，必须贴附于支持物表面才能生长的细胞，贴壁后一般呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。贴壁细胞在培养瓶长成致密单层厚，继续生长的空间不足，培养基中的营养成分也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需进行分瓶培养，对细胞进行传代扩增。对于贴壁不太紧的细胞如colo320，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如HeLa、colo205贴壁细胞，则需要以细胞消化液消化后才能脱落和分散。常用的消化液为胰蛋白酶。胰酶消化的原理：胰酶是一种蛋白酶，通过特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养瓶壁结合处蛋白降解，致使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。细胞消化用胰蛋白酶常用的工作液浓度为0.25%，PH为7.2-7.4之间。胰酶消化的程度是一个关键：消化过度会对细胞活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，甚至造成细胞破碎；消化不足则细胞难于从瓶壁吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。一般消化时间为1至3分钟，肉眼观察瓶壁由半透明转为点状透明时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。三、仪器、材料和试剂超净工作台微量加样器（移液枪）倒置显微镜高压灭菌锅蒸馏水器超低温冰箱二氧化碳培养箱（一）仪器（二）用具、材料细胞培养瓶滴管培养细胞四、实验步骤

1.RPMI1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI1640培养液

44——谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清5—10%NaHCO3调pH至7.02、传代培养步骤（以下均为无菌操作）从培养箱中取出原代培养细胞并置于超净工作台，弃去培养液，加入0.6ml的0.25%胰酶溶液，以使细胞贴壁面充分浸润，当见到细胞贴壁面的瓶壁出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量培养液终止消化，吹打分散。细胞计数：取5ul细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。如果样本成活率高，无污染即可用于传代。(计数结果：4.5×106个/ml)。将细胞分装至新鲜的培养液中，使细胞的最终数量调节至1×105～3×105个/mL。置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。具体操作：每两个小组共用一个培养瓶配制100ml的生长培养基每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内向细胞培养瓶内接种400ul的HeLa细胞株原液放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置观察倒置显微镜的使用方法利用课余时

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