第二章-3蛋白质化学

第五节蛋白质的重要性质一、蛋白质的胶体性质真溶液的溶质分子的颗粒大小<1nm；胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在1-100nm；蛋白质分子的相对分子量在1-100万，其颗粒大小(2-20nm)属于胶体粒子的范围。

另外，蛋白质分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶与水形成稳定的亲水胶体溶液。1、稳定蛋白质胶体溶液的两个因素∶

(1)表面电荷(在非等电点时)与双电层；

(2)水化膜蛋白质胶体溶液具有一般胶体溶液的性质∶

丁道尔现象、布朗运动、半透膜不透性、吸附性、胶凝性、粘性。2、蛋白质的膜分离技术（MembraneSeparationTechnique

）利用蛋白质的半透膜不透性，将蛋白质中所含的、可以通过半透膜将低分子物质(如盐等小分子)分离的技术称为膜分离技术(或膜过滤技术)。

膜分离技术可分为∶透析（dialysis

）超滤（ultrafiltration

）超滤膜孔径与截留蛋白质分子量的对应关系膜孔平均直径（10－8cm）

分子量截留值

膜孔平均直径（10－8cm）

分子量截留值10500223×104121000305×104151×1045510×104182×10414030×104

二、蛋白质的两性解离与等电点蛋白质中可解离的酸性基团∶Glu的γ-COOHAsp的β-COOHTyr的酚羟基Cys的-SH

碱性基团∶Lys的ε-NH2His的咪唑基Arg的δ-胍基蛋白质分子的总解离可用下式表示∶

NH+3-P-COOH(P+)NH+3-P-COO-(P+-)

NH2-P-COO-(P-)

蛋白质的等电点∶蛋白质溶液在特定的pH下，其分子所带的正、负电荷相等，净电荷为零，这一pH称为(用pI表示)。

蛋白质的等电点不是一个恒定值，它受溶液的离子种类和离子强度的影响。 蛋白质在纯水中的带电状态不受其它离子的干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为蛋白质的等离子点(isoionicpoint)

。

蛋白质的等离子点是特性常数。

蛋白质等电点的大小与其氨基酸组成有关。对于变性的蛋白质，可由其酸性氨基酸与碱性氨基酸的比例来判断。对于天然蛋白质，由于其R基团不能完全暴露在外，故不易判断。几种蛋白质的等电点蛋白质

等电点

蛋白质

等电点胃蛋白酶

1.0卵清蛋白

4.6血清蛋白

4.7β-乳球蛋白

5.2胰岛素

5.3血红蛋白

6.7α-胰凝乳蛋白酶

8.3核糖核酸酶

9.5细胞色素C10.7溶菌酶

11.0在等电状态下，蛋白质分子物理性质有所改变，最显著的是溶解度最小。（a）高pH：蛋白质溶解（去质子化）；（b）等电点：蛋白质絮凝（静电排斥最小）（c）低pH：蛋白质溶解（质子化）；（d）β-乳清蛋白的溶解度与pH的关系

根据蛋白质两性解离和等电点的性质发展起来的蛋白质纯化方法有∶蛋白质电泳离子交换法等电点沉淀法

三、蛋白质的变性作用（proteindenaturation

）1、概念天然的蛋白质在受到某些物理或化学因素的作用，有序的空间结构被破坏，致使生物活性丧失，并伴随发生一些理化性质的异常变化，但一级结构并未破坏，这种现象称为蛋白质的变性作用。2、蛋白质变性的可逆性

可逆变性∶是指使蛋白质变性的条件解除 后，能恢复其原有性质。

不可逆变性∶是指使蛋白质变性的条件解除 后，仍不能恢复其原有性质。蛋白质复性（renaturation）去除变性因素后，可逆变性的蛋白恢复原来的空间结构，恢复生物活性的现象为复性3、蛋白质的变性因素及其作用机理物理因素热、UV、超声波、X-射线、高压、表面张力、搅拌、剧烈振荡、研磨。例如皮肤粗糙、白内障、杀菌化学因素酸、碱、有机溶剂、重金属盐、脲、胍、表面活性剂、生物碱。作用机理

重金属——与-SH生成不溶性的硫化物浓乙醇、去污剂——破坏疏水作用力4、变性蛋白质的性质变性蛋白质与天然蛋白质性质的差别主要表现∶(1)理化性质的变化

如：旋光性改变、粘度增加、光吸收性质增加、失去结晶能力、溶解度下降、易发生凝聚和沉淀。(2)生化性质的变化

变性后的蛋白质易被酶水解。(3)生物活性丧失

这是蛋白质变性的重要标志。

四、蛋白质的变构作用（proteinallostericeffect

)对于具有四级结构、含有亚基的蛋白质来讲，当一个亚基的构象发生变化，而引起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功能发生改变的作用称为蛋白质的变构作用(或称别构作用）。如∶血红蛋白的变构作用五、蛋白质的沉淀作用（precipitation）

1、概念蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的，若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮凝沉淀的现象，就称为蛋白质的沉淀作用。蛋白质的沉淀可分为∶不变性沉淀∶用于分离活性的天然蛋白质产品。

如：酶、抗体等。变性沉淀∶用于生物制品中除去蛋白质。2、沉淀的方法(1)等电点沉淀蛋白质分子在其等电点时，容易相互吸引，聚合成沉淀(2)中性盐沉淀盐析（saltingout)∶在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐后，它与蛋白质胶体粒子竞争水份，使蛋白质胶体粒子表面的水化层破坏而失去稳定性，同时降低了蛋白质与水的亲和力而使蛋白质沉淀的现象。

盐溶（saltingin)∶在盐浓度很低时，大多数蛋白质的溶解度随着盐浓度的增加而增加，这种现象称为蛋白质的盐溶。

低浓度的盐可增加蛋白质表面的电荷数量和与水分子的相互作用。盐析盐浓度高时，中和了蛋白质分子表面的电荷、破坏了水化层，使疏水区域暴露，疏水基团发生相互作用而沉淀。

不同的蛋白质的带电性质、分子量不同，水膜厚度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。

分级盐析

一般来讲，分子量越大的蛋白质分子，越容易盐析，所需盐浓度也越低。因此，对于不同分子大小的蛋白质，可采用不同的盐浓度进分级沉淀。

常用的盐是∶(NH4)2SO4

(3)有机溶剂沉淀一些极性的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)能破坏蛋白质胶粒的水化层，使疏水基团暴露使蛋白质沉淀。(4)重金属盐沉淀蛋白质在碱性溶液中带负电，可与重金属离子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，产生重金属蛋白盐沉淀。(5)热变性沉淀(6)生物碱试剂沉淀生物碱试剂（如单宁酸、钼酸、钨酸、三氯醋酸等）具有酸性，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，故能与带负电的酸根相结合，成为溶解度很小的盐类。六、蛋白质的沉降作用（sedimentation)1、概念

蛋白质由于其比重大于水，而水中下沉，这就是蛋白质的沉降作用。蛋白质胶体粒子在静止溶液中，因重力F=mg很小，沉降1cm需几年的时间。为了便于观察和利用这一现象，通常外加一定的力（如离心力），来加速沉降过程。

蛋白质的沉降速度与分子大小和密度有关。蛋白质的沉降性能通常用单位离心力场中的沉降速度－－沉降系数来表示

（沉降系数的测定详见后面的蛋白质分子量测定）

七、蛋白质的水解反应∶可分为∶完全水解，产物是氨基酸。

不完全水解，产物可以是胨、小肽、二肽和氨基酸。八、蛋白质的颜色反应∶（1）一般颜色反应：

氨基酸所具有的颜色反应一般情况下蛋白质都有。

一些氨基酸地R基团具有特殊地颜色反应：米伦反应红色酚基黄色反应黄色苯基酚试剂反应蓝色酚基、吲哚基坂口反应红色胍基（2）特殊颜色反应－－双缩脲反应

两个以上肽键（双缩脲）在碱性溶液中与硫酸铜结合。生成紫红色或红色物质。九、蛋白质的紫外吸收性质∶

一般蛋白质在280nm波长具有最大吸收，这是由于蛋白质分子中的Trp、Tyr和Phe存在共轭双键的缘故。

十、蛋白质的免疫学性质抗原Ag：刺激机体免疫系统产生特异免疫反应的物质，特点是异物性、大分子性和特异性抗体。Ab：抗原刺激机体产生能与抗原特异结合的蛋白质，存在于电泳γ-区（γ-、免疫球蛋白Ig）,抗体的特异性决定于抗原的表面基团，免疫产生抗体多种，多克隆抗体免疫反应：抗原与抗体结合引起的反应，是人类对疾病具有抵抗力的重要标志正常免疫反应：机体保护作用；异常免疫反应：机体有害的病理性免疫反应半抗原：不具抗原性的小分子物质，与蛋白结合后具有抗原性，这里小分子为半抗原此性质在食品加工中也具有重要应用蛋白质的相对分子质量一般在6000至100万常用的测定方法有:1、根据化学组成测定最低相对分子质量2、渗透压法测定相对分子质最3、凝胶过滤法测定相对分子质量4、凝胶电泳法测定相对分子质量5、沉降法测定相对分子质量第六节蛋白质相对分子质量的测定1、凝胶过滤法原理：将具网状结构的葡聚糖凝胶装柱，对分子量不同的蛋白质，由于进入多孔性凝胶颗粒的能力不同而在流动相流动过程中所走路径不同，从而有不同的洗脱体积，来达到分离。凝胶法只适于测定球状蛋白分子的相对质量洗脱体积与相对分子质量的关系相对分子质量的对数洗脱体积（mL）聚丙烯酰胺凝胶具网状结构，作为电泳介质

SDS——十二烷基硫酸钠【CH3(CH2)11OSO3Na】

它是一种阴离子表面活性剂，也是一种有 效的蛋白变性剂

通常在待测分子量的蛋白质样品中加入巯基乙醇和SDS。 巯基乙醇打开蛋白质分子二硫键；

SDS破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，并与之形成Pr-SDS复合物2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）SDS-Pr复合物的特点：复合物带大量负电，使得不同Pr电荷密度相同使球状Pr变成雪茄状，长轴∝MW电泳时迁移率仅与蛋白质分子量（MW或分子的长轴）有关，而与分子形状和带电状态无关。原理：

不同分子量的Pr颗粒会以不同的速度沉降下来。用特殊的光学系统可观察到沉降界面，从而得pr沉降速度。3、超离心沉降法蛋白质的沉降常数(沉降系数,SvedbergUnite)∶不同的蛋白质由于其分子大小不同，在一定的离心力场中沉降的速度也不同。沉降的速度是蛋白质在单位时间内下沉的距离，即v=dx/dt。沉降常数(s小写)∶单位引力场中沉降分子的下沉速度。它表示沉降分子的大小特性。

s=v（沉降速度）/ω2（角速度）x（颗粒距中心距离）沉降常数是蛋白质的特征性常数，它反应蛋白质分子的大小。

由于已知的蛋白质分子的沉降常数在1×10-13～200×10-13秒之间，把1×10-13s这一沉降系数值定为一个斯维德伯(Svedberg)氏单位(s)，沉降常数为1×10-13

(简写为1S，大写)。

蛋白质的相对分子质量：M∝s

斯维德贝格公式（Svedberg)M=RTs/D(1-νρ）其中：M：蛋白质的相对分子质量

s：为沉降系数，单位秒或“S”一般Pr的“s”在1～200×10-13秒

范围内，为方便将10-13秒

作一个单位——漂浮单位“S” D：扩散系数；

ν：蛋白质的偏微比容（0.74cm3/g）；

ρ：溶剂的密度；

R：气体常数；

T：绝对温度一些蛋白质的物理常数蛋白质

相对分子量

扩散系数

沉降系数

摩擦比（D20，w×107）cm2s－1

（s020，w×1013）s

（f/f0）核糖核酸酶A（牛）

1260011.91.851.14细胞色素C（牛心肌）

1337011.41.711.19肌红蛋白（马心肌）

1690011.32.041.11胰凝乳蛋白酶原（牛胰）

232409.502.541.19血清清蛋白（人）

685006.104.61.29血红蛋白（人）

645006.904.461.16过氧化氢酶（马肝）

2475004.1011.31.25血纤蛋白原（人）

3397001.987.632.34肌球蛋白（鳕鱼肌）

5248001.106.433.63烟草花叶病毒