第二章 蛋白质化学 生物化学简明教程

第二章蛋白质化学蛋白质（Protein）是由许多不同的

-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。体内的大部分生命活动，是在蛋白质的参与下完成的。2.1蛋白质的分类元素分析发现蛋白质一般含碳(50%～55%)，氢(6%～8%)，氧(20%～23%)，氮(15%～18%)，硫(0%～4%)。有些蛋白质还含有微量的磷、铁、铜、碘、锌和钼等元素。蛋白质的平均含氮量为16%，即每lg蛋白质中的氮相当于6.25g蛋白质。凯氏(Kjeldahl)定氮法蛋白质含量=（总氮含量-无机氮含量）×6.252.1.1根据分子形状分类球状蛋白质 形状接近球形，水溶性较好，可行使多种多样的生物学功能。纤维状蛋白质 分子外形呈棒状或纤维状，大多数不溶于水，是生物体重要的结构成分，或对生物体起保护作用，如胶原蛋白和角蛋白。有些可溶于水，可在一定的条件下聚集成固态，如血纤维蛋白原。还有一些与运动机能有关，如肌球蛋白。有些纤维状蛋白质是由球蛋白聚集形成的，一般归类于球蛋白，如微管蛋白和肌动蛋白。膜蛋白质 折叠成近球形，插入生物膜，也有一些通过非共价键或共价键结合在生物膜的表面。生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。2.1.2根据分子组成分类简单蛋白质（simpleprotein） 仅由肽链组成，不包含其他辅助成分的蛋白质。根据溶解度的差别不同，可分为7类。结合蛋白质（又称缀合蛋白质，conjugatedprotein） 由简单蛋白质和辅助成分组成，其辅助成分通常称为辅基。根据辅基的不同，可分为5类。2.1.3根据功能分类蛋白质结构与功能关系的研究，蛋白质一蛋白质，及蛋白质一核酸等生物大分子相互关系的研究进展很快，因此提出按蛋白质的生物功能进行分类的方法。按功能将蛋白质分为10类。携带能够完成人体的生理功能的蛋白质，它们主要是完成人体的各种代谢活动。包括绝大多数的酶、胰岛素和生长激素等动物激素、生物膜上的载体蛋白、抗体、受体、血红蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、淋巴因子。酶具催化活性的蛋白质，每一步生化反应都是由特定的酶催化完成的。调节蛋白具有调控功能的蛋白质。一类为激素，另一类参与基因表达的调控。贮存蛋白在细胞内形成贮存蛋白颗粒，为生命活动提供蛋白质和氨基酸的蛋白质。转运蛋白在营养物质摄取，代谢产物释放以及信号转导等广泛的细胞活动中起着重要的作用的蛋白质。运动蛋白在生物的运动过程中起生理功能的蛋白质。防御蛋白和毒蛋白具有防御和保护功能的蛋白质。（病毒外壳）受体蛋白接受和传递信息的蛋白质。支架蛋白信号转导系统存在一种本身不具备酶活性的蛋白质。结构蛋白用于建造和维持生物体结构的蛋白质。异常功能蛋白一类具有特殊的功能的蛋白质。2.2蛋白质的组成单位—AA氨基酸（aminoacid）广义上是指分子中既有氨基又有羧基的化合物。蛋白质的基本组成单位，从细菌到人类,蛋白质由20种氨基酸组成。除脯氨酸外，其余19种都是氨基位于-碳原子上的-氨基酸。确切地说，脯氨酸不是氨基酸，而是一种亚氨基酸什么是α-氨基酸？----C-C-C-C-COOHγβα----C-C-C-C(NH2)-COOHα-氨基酸----C-C-C(NH2)-C-COOHβ-氨基酸----C-C(NH2)-C-C-COOHγ-氨基酸2.2.1氨基酸的结构通式氨基酸的氨基和羧基结合到α碳原子，同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R）；L-氨基酸RC＋NH3HCOO－甘氨酸HC＋NH3HCOO－丙氨酸CH3C＋NH3HCOO－Cα如是不对称C（除Gly），则：1、具有两种立体异构体D-型和L-型2、具有旋光性左旋（

－

）或右旋（＋）两性离子形式

＋H3NCαHCOO－R不带电形式

H2NCαHCOOHR（1）非极性R基AA2.2.2氨基酸的分类在研究氨基酸的分离方法，或考虑其在形成蛋白质分子空间结构中的作用时，较好的分类方式是按照R基的极性，和在中性条件下带电荷的情况，将其分作4类。（1）非极性R基氨基酸（2）不带电荷的极性R基氨基酸（3）极性带正电荷的R基氨基酸（4）极性带负电荷的R基氨基酸（２）不带电荷的极性Ｒ基AA（3）带正电荷的Ｒ基AA（4）带负电荷的Ｒ基AA根据氨基酸R基侧链的结构脂肪族、芳香族和杂环族3类。在研究氨基酸的代谢途径时，采用这种分类方式较好。（1）脂肪族氨基酸--中性AA甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）缬氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）异亮氨酸（Ile,I）（1）脂肪族氨基酸--含羟基或硫AA丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）丝氨酸（Ser,S）甲硫氨酸（Met,M）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）（1）脂肪族氨基酸--酸性AA及其酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酰胺（Gln,Q）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）（1）脂肪族氨基酸--碱性AA赖氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）赖氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）（2）芳香族氨基酸色氨酸（Trg,W）苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）（3）杂环氨基酸组氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）几种特殊氨基酸脯氨酸。因为它是一个环状的亚氨基酸。它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的酰胺键有明显的特点，较易变成顺式肽键。甘氨酸。因为它是唯一的在-碳原子上只有两个氢原子，没有侧链的氨基酸。为此它既不能和其它残基的侧链相互作用，也不产生任何位阻现象，进而在蛋白质的立体结构形成中有其特定的作用。半胱氨酸。它不仅在其侧链有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还在于两个半胱氨酸能形成稳定的带有二硫（桥）键的胱氨酸。二硫键不仅可以在肽链内，也可以在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键能具有不同的空间取向。根据氨基酸R基侧链的极性

疏水性氨基酸（非极性氨基酸）亲水性氨基酸（极性氨基酸）不带电荷的极性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带负电荷的碱性氨基酸根据氨基酸R基侧链的结构脂肪族氨基酸

中性氨基酸含羟基或硫氨基酸碱性氨基酸酸性氨基酸及其酰胺芳香族氨基酸杂环族氨基酸SerThrTyrAsnGlnCysGlyAlaValIleLeuProMetpheTrpLysArgHisAspGluGlyAlaValLueIleSerThrCysMetLysArgAspGluAsnGlnPheTryTrgHisPro根据营养学分类必需氨基酸非必需性氨基酸根据氨基、羧基数分类一氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸一氨基二羧基氨基酸Lys

ValIleLeupheMetTrpThrLys

His

Arg除8种必需AA以外所有的AAGlu

Asp不带电荷的15种AA存在于少数蛋白质中特有的氨基酸，是在蛋白质生物合成后由相应的基本氨基酸衍生来的被称为不常见的氨基酸。5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸：由赖氨酸和脯氨酸经羟基化而生成，存在于胶原蛋白中。甲状腺素、3，3´，5-三碘甲腺原氨酸：由酪氨酸的碘化衍生物，存在于甲状腺球蛋白中。甲基组氨酸、ε-N-甲基赖氨酸和ε-N，

N，

N-三甲基赖氨酸：甲基化的氨基酸，存在于肌肉蛋白中-羧基谷氨酸：存在于许多和凝血有关的蛋白质中焦谷氨酸：存在于细胞紫膜质中，是一种光驱动的质子泵蛋白质N-甲基精氨酸、N-乙酰赖氨酸：存在与染色体缔合的组蛋白中有些氨基酸不是蛋白质的组成成分，但能以游离或结合的形式存在于生物界，这些氨基酸统称为非蛋白质氨基酸。它们中有的是L-型-氨基酸的衍生物，有的是-、-、-氨基酸，有的是D-型氨基酸。L-瓜氨酸、L-鸟氨酸：尿素循环的中间体-丙氨酸：遍多酸（泛酸）（一种维生素）的前体成分-氨基丁酸：传递神经冲动的化学介质，存在于脑中，用于治疗癫痫、记忆障碍等脑病-氨基--羟基丁酸：具有解痉作用D-丙氨酸、D-谷氨酸：细菌细胞壁中的肽聚糖中D-苯丙氨酸：一种抗生素短杆菌肽S成分鸟氨酸瓜氨酸氨基酸还参与代谢作用，不少已用来治疗疾病。甘氨酸：对芳香族物质起解毒作用酪氨酸：合成甲状腺素和肾上腺素的前体精氨酸：参与鸟氨酸循环，用于因血氨升高引起的肝昏迷谷氨酸与谷胺酰胺：用于改善脑出血后遗的记忆障碍谷胺酰胺和组氨酸：用于治疗消化道溃疡亮氨酸：加速皮肤和骨头创伤愈合，降血糖及头晕治疗药医药上氨基酸主要用于复合氨基酸输液2.2.2氨基酸的理化性质

--物理性质形态：白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。溶解性：溶于水（除Tyr），不溶或微溶于醇，不溶于丙酮（除Pro），在稀酸和稀碱中溶解性好。熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，大约200~300℃之间，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。光吸收：在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收。色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（200~400nm）：Tyr、Trp、Phe都含有它们含有苯环共轭双键系统原因：含有共轭双键的都有吸收紫外线的特性－C＝C－C＝C－C＝C－C＝C－Try：λmax=275nmε275=1.4×103

Phe：λmax=257nmε257=2.0×102

Trp：λmax=280nmε280=5.6×103

蛋白质由于含有Tyr、Phe、Trp这些氨基酸，也有紫外光吸收能力，一般最大吸收在280nm处。2.2.2氨基酸的理化性质

--两性解离和等电点氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的－NH3+正离子和能接受质子的－COO－负离子，为两性电解质。调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的－NH3+基和－COO－基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。

OH－H＋OH－H＋（pK1）（pK2）净电荷为正净电荷为负净电荷为0在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。作为缓冲试剂使用 在水溶液中氨基和羧基的解离程度是不同的，所以氨基酸水溶液一般不呈中性。一般来讲所谓中性氨基酸，酸性比碱性稍微强一点，也就是正离子的浓度小于负离子的浓度，要调节到等电点，就需要向溶液中加酸，降低pH，抑制羧基的解离。中性氨基酸的等电点一般在5.0～6.3，酸性氨基酸约在2.8～3.2，碱性氨基酸为7.6～10.9。利用各种氨基酸的等电点不同，可以通过电泳法、离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合氨基酸的分离或制备。 在pH≈6时，甘氨酸、丙氨酸等主要以两性离子形式存在，而天冬氨酸、谷氨酸等则主要是以负离子形式存在。用阴离子交换树脂柱层析分离时，甘氨酸和丙氨酸等中性氨基酸可因R基极性不同先后被洗脱出来，而天冬氨酸和谷氨酸和树脂的阴离子交换而留在柱中，需要根据它们的pI值，选用较低pH的缓冲溶液才能洗脱出来。等电点时，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。 利用这一性质例如谷氨酸的生产，就是将微生物发酵液的pH值调节到3.22（谷氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。氨基酸等电点的确定酸碱滴定（滴定曲线）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。

即：

pI＝(pK1+pK2)/2orpI＝(pK2+pK3)/2pI=2pK1+pK2一氨基一羧基AA：pK1：α－COOH的解离平衡，pK2：α－NH3的解离平衡pI=2pK1+pK2一氨基二羧基AA：pK1：α－COOH的解离平衡，pK2：－COOH的解离平衡pI=2pK2+pK3二氨基一羧基AA：pK2：α－NH3的解离平衡，pK3：－NH3的解离平衡Cys除外，pK2：α－SH的解离平衡各个氨基酸的等电点见p22表2-2以Ala为例说明一氨基一羧基的氨基酸的等电点的计算当[Ala＋]和[Ala－]相等时，溶液的pH即为等电点，所以pI＝(pK1+pK2)/2以Asp为例说明一氨基二羧基的氨基酸的等电点的计算以Lys为例说明一氨基二羧基的氨基酸的等电点的计算（1）（2）（3）（1）（3）（2）2.2.2氨基酸的理化性质

--化学性质与水合茚三酮的反应与甲醛的反应与2,4－二硝基氟苯（DNFB）的反应与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应与亚硝酸反应与荧光胺反应与5,5－双硫基－双（2－硝基苯甲酸）反应（1）与水合茚三酮的反应茚三酮水合茚三酮α-氨基酸与水合茚三酮试剂共热，可发生氧化脱羧反应生成蓝紫化合物，570nm

。对脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成黄色化合物，440nm反应生成的化合物的颜色深浅程度以及CO2生成量，均可作为氨基酸定量分析依据。（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法NaOH滴定不仅用于测定氨基酸含量，也常用来测定蛋白质水解程度（3）与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的反应Sanger法测定N末端氨基酸基础NO2－F＋HN－CH－COOHO2N－R－－NO2－N－CH－COOH＋HFO2N－R－－弱碱性DNFBDNP-氨基酸－N－CH3CH3－－－O＝S＝O－ClH2N－CH－COOH＋R－N－CH3CH3－－－O＝S＝O－HN－CHCOOHR5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）DNS-氨基酸pH9.740℃取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高－N－C－N－CH－COOH－H＝S－H－N＝C＝S＋H－N－CH－COOH－H－R－N－C＝S\/O＝CN－H//H－C－RPTH-氨基酸苯乙内硫脲衍生物PTC-氨基酸苯氨基硫甲酰衍生物PITC（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应无水HFpH8.3重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”（5）与亚硝酸的反应VanSlyke法测氨基氮（体积）的基础。N2中的1/2为氨基氮。氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定（6）与荧光胺反应

根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。激发波长λx=390nm，发射波长λm=475nm。

作用与丹磺酰氯相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，产生荧光。（7）与5,5－双硫基－双（2－硝基苯甲酸）反应测定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩尔消光系数ε=13600）2.3肽（peptide）AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。2.3.1肽的结构氨基酸通过肽键（peptidebond）相互连接而形成多肽和蛋白质。肽键是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽。含100个以上氨基酸的多肽（有时是含50个以上）称为蛋白质。肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。多肽链（polypeptidechain）是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。多肽链有方向性：从氨基末端走向羧基末端

氨基末端（aminoterminal）或N末端：多肽链中有自由氨基的一端

羧基末端（carboxylterminal）或C末端：多肽链中有自由羧基的一端如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnN末端C末端牛核糖核酸酶

肽键是一个刚性的平面参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式（trans）构型，此同一平面上的6个原子构成了肽单元（peptideunit）。C–C–N–C

肽骨架（peptidebackbone）肽键中C-N键有部分双键性质----不能自由旋转组成肽键原子处于同一平面（肽平面）键长及键角一定大多数情况以反式结构存在2.3.2生物活性肽的功能生物活性肽（biologicalactivepeptide，BAP）是能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性的寡肽和多肽的总称。大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，被酶解成适当的长度时，其生理活性才会表现出来。参与调节物质代谢、激素分泌、神经活动、细胞生长及繁殖等几乎所有的生命活动。（1）谷胱甘肽（glutathione,GSH）谷氨酸甘氨酸半胱氨酸谷胱甘肽是某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要作用；参与二硫化合物相互转化GSH过氧化物酶H2O22GSH

NADP+2H2OGSSGNADPH＋H+

GSH还原酶GSH容易氧化，二分子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）生理功能解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

（2）催产素和加压素

SS牛催产素

Cys·Tyr·Ile·Gln·Asn·Cys·Pro·Leu·Gly-NH2SS牛加压素

Cys·Tyr·Phe·Gln·Asn·Cys·Pro·Ary·Gly-NH2均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。加压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。牛催产素牛加压素

牛催产素（3）促肾上腺皮质激素（ACTH）

39肽，活性部位为第4-10位的7肽片段Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly

大脑分泌的ACTH参与意识行为的调控；腺垂体分泌的ACTH主要作用于肾上腺皮质

刺激肾上腺皮质的生长和肾上腺皮质激素的合成和分泌，临床上用于柯兴氏综合征的诊断，风湿性关节炎、皮肤和眼睛炎症的治疗（4）脑肽（内啡肽，内源和吗啡的缩略词）Met-脑啡肽（5肽）Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽（5肽）Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

脑啡肽（β-内啡肽，31肽）具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。吗啡吗啡是鸦片中最主要的生物碱（含量约10-15%），1806年法国化学家F·泽尔蒂纳首次从鸦片中分离出来。用分离得到的白色粉末在狗和自己身上进行实验，结果狗吃下去后很快昏昏睡去，用强刺激法也无法使其兴奋苏醒；他本人吞下这些粉末后也长眠不醒。据此他用希腊神话中的睡眠之神吗啡斯（Morphus）的名字将这些物质命名为“吗啡”。脑啡肽（endorphin）亦称內啡肽，是一种内成性（脑下垂体分泌）的类吗啡生物化学合成物激素。它能与吗啡受体結合，产生跟吗啡、鸦片剂一样有止痛和快感。等同天然的镇痛剂。1975年，两个小组分别自猪脑和牛脑中发现。runner'shigh2.3.3活性肽的来源内源性生物活性肽

如谷胱甘肽、神经肽、催产素、加压素、心房肽等，在生物体内游离存在。外源性生物活性肽

微生物、动植物蛋白中分离出的具有潜在生物活性的肽类，它们在消化酶的作用下释放出来，以肽的形式被吸收后，参与摄食、消化、代谢及内分泌的调节，这种非机体自身产生的却具有生物活性的肽类称为外源性生物活性肽。体内途径

体内的活性肽多数是从非活性的蛋白质前体经特殊的酶系加工而形成的，加工修饰包括多肽链裂解、酰化、乙酰化和硫脂化等。体外途径目前生物活性肽的生产方法有：分离纯化存在于生物体中的各类天然活性肽，或利用重组DNA技术、酶法、化学法合成活性肽。 ①分离纯化天然活性肽②化学合成制备活性肽③生物合成制备活性肽④酶法水解制取活性肽2.3.3活性肽的应用目前研究的主要外源性生物活性肽有外啡肽、免疫调节肽、抗微生物肽、抗凝血肽、抗应激肽、抗氧化肽等。生物活性肽在生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老及分子进化等方面起着重要的作用，具有涉及神经、激素和免疫调节、抗血栓、抗高血压、抗胆固醇、抗细菌病毒、抗癌、抗氧化、清除自由基等多重功效。乳肽：主要由动物乳中酪蛋白与乳清蛋白酶解制得，更易溶解于水和被人体消化吸收，耐酸、耐热，是最广的保健食品素材。大豆肽：由大豆蛋白酶解制得。具有低抗原性、抑制胆固醇、促进脂质代谢及发酵等功能。用于食品能快速补充蛋白质源，消除疲劳以及作为双歧杆菌增殖因子。玉米肽：由玉米蛋白酶解制得。具有抗疲劳，改善肝、肾、肠胃疾病患者营养的功能，并可促进酒精代谢，用做醒酒食品。水产肽：各种鱼肉蛋白酶解制得的肽，如沙丁鱼肽，是血管紧张素转换酶抑制肽，不含苦味，用于制作防治高血压的保健食品或制剂。丝蛋白肽：蚕茧丝蛋白经酶解制得的低肽，具有促进酒精代谢、降低胆固醇、预防痴呆等多种功能，用于醒酒食品和特种保健食品。乳肽：主要由动物乳中酪蛋白与乳清蛋白酶解制得，更易溶解于水和被人体消化吸收，耐酸、耐热，是最广的保健食品素材。大豆肽：由大豆蛋白酶解制得。具有低抗原性、抑制胆固醇、促进脂质代谢及发酵等功能。用于食品能快速补充蛋白质源，消除疲劳以及作为双歧杆菌增殖因子。玉米肽：由玉米蛋白酶解制得。具有抗疲劳，改善肝、肾、肠胃疾病患者营养的功能，并可促进酒精代谢，用做醒酒食品。水产肽：各种鱼肉蛋白酶解制得的肽，如沙丁鱼肽，是血管紧张素转换酶抑制肽，不含苦味，用于制作防治高血压的保健食品或制剂。丝蛋白肽：蚕茧丝蛋白经酶解制得的低肽，具有促进酒精代谢、降低胆固醇、预防痴呆等多种功能，用于醒酒食品和特种保健食品。抗菌肽：如植物、微生物、昆虫和脊椎动物在微生物感染时迅速合成而得如乳链菌肽，具有很强杀菌作用。抗菌肽主要用于食品防腐保鲜。吗啡片肽：源于动物乳中酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白分离和血红蛋白、植物蛋白酶解而得，具有镇痛、调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温、消化系统及内分泌等功能。血管紧张素转换酶抑制肽：从天然蛇毒中分离和细菌胶原酶降解胶原蛋白或牛乳酪蛋白、大豆、玉米、沙丁鱼、磷虾蛋白等酶解而制得，具有降血压的显著功效。抑制胆固醇作用肽：大豆等植物蛋白经胃蛋白酶或胰酶作用而制得，用于降胆固醇的保健食品。肝性脑病防治肽：系由动物或植物蛋白酶解制得，用于防治肝性脑病药品和护肝保健食品或抗疲劳食品。2.4蛋白质的结构一级结构（primarystructure）二级结构（secondarystructure）三级结构（tertiarystructure）四级结构（quaternarystructure）蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。高级结构或空间构象(conformation)高级结构或空间构象(conformation)2.4.1蛋白质的一级结构蛋白质一级结构（primarystructure）是指蛋白质分子中，从N端到C端的氨基酸排列顺序。形成一级结构的化学键：肽键（主要化学键）二硫键（两个半胱氨酸构成）一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。2.4.2蛋白质的空间结构蛋白质的空间结构通常称作蛋白质的构象，或高级结构，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布和肽链的走向。二级结构（secondarystructure）三级结构（tertiarystructure）四级结构（quaternarystructure）一般从二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构等几个结构层次进行描述。高级结构或空间构象(conformation)维持蛋白质空间构象的作用力主要是次级键，即氢键和盐键等非共价键，以及疏水作用（疏水键）和范德华力等。

氢键：一个电负性原子上共价连接的氢，与另一个电负性原子之间的静电作用力。盐键：也称离子作用，既包括不同电荷间的静电引力，也包括相同电荷间的静电斥力。疏水键：由于氨基酸疏水侧链相互聚集形成的作用力。范德华力：由瞬间偶极诱导酌静电相互作用形成的，它是由于邻近的共价结合原子电子分布的波动引起的。（1）稳定蛋白质空间结构的作用力指多肽主链有一定周期性的，由氢键维持的局部空间结构。因为蛋白质主链上的C=O和N-H是有规则排列的，所以C＝O和H－N之间形成的氢键通常有周期性，使肽链形成-螺旋、-折叠、-转角等有一定规则的结构。即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)-折叠(-pleatedsheet)-转角(-turn)无规卷曲(randomcoil)

维系二级结构的主要化学键：氢键（2）蛋白质的二级结构（secondarystructure）①

-螺旋(-helix

，Pauling和Corey于1965年提出）由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象以肽键平面为单位,以α－碳原子为转折盘旋形成右手螺旋肽键平面与中心轴平行每3.6个氨基酸残基绕成一个螺圈（360°）螺距为0.54nm每个氨基酸上升0.15nm螺旋体中所有氨基酸残基R侧链都伸向外侧，链中的全部＞C＝O

和＞N－H几乎都平行于螺旋轴氢键是稳定螺旋的主要作用力每个氨基酸残基的＞N－H与前面第四个氨基酸残基的＞C＝O形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。多个肽键平面通过α－碳原子紧密盘曲成稳固的右手螺旋。主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距0.54nm。相邻两圈螺旋之间借肽键中C＝O和N－H之间形成许多链内氢健，每一个氨基酸残基中的N－H和前面相隔三个残基的C＝O之间形成氢键。肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧。（1）为一右手螺旋（2）螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm（3）螺旋以氢键维系（4）氨基酸侧链伸向外侧总结其他类型的螺旋310-螺旋

直径0.4nm

螺距0.6nm4.416-螺旋直径0.6nm螺距0.52nm②

β-折叠（β-pleatedsheet）肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称β－折叠。常为两条或两条以上伸展的多肽链；侧向聚集在一起形成扇面状，故又称β－折叠或β－片层。

相邻肽键平面的夹角为110°，呈锯齿状排列；侧链Ｒ基团交错地分布在片层平面的两侧。相临AA之间的距离是0.35nm2~5条肽段平行排列构成，肽段之间可顺向平行（均从N－C），也可反向平行。反向平行顺向平行由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴接近垂直。能量上看，反式比平行更稳定（氢键最强）。纤维状蛋白质中，主要以反式存在，球状蛋白质中两种方式都存在。肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角，R侧链在锯齿的上方或下方两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C＝O与N－H之间形成氢键两段肽链平行，也可以是反平行的两个残基的间距为0.65nm；反平行的－片层结构，则间距为0.7nm③

-转角（β-turn）肽链出现180°回折的转角处结构称为β－转角（发夹结构），经常出现在连接反平行β－折叠片的端头。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHO转角结构通常负责各种二级结构单元之间的连接作用，它对于确定肽链的走向起着决定性的作用。第一个残基的C＝O与第四个残基的N－H形成氢键常见于球状蛋白质分子表面不很稳定的环状结构在－转角部分，由四个氨基酸残基组成④

无规卷曲（rndomcoil）没有确定规律性的肽键构象常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲折叠H2NCOOH明确而稳定的二级结构无规卷曲常构成酶的活性部位或其他蛋白质特异的功能部位细胞色素C的三级结构烫发是一项生化工程蛋白质构象稳定的原因：1）酰胺平面；2）R的影响。一段肽链有多个酸性氨基酸残基相邻，则在pH7.0时这些残基的游离羧基都带负电荷，彼此相斥，妨碍－螺旋的形成。同样，多个碱性氨基酸残基在一肽段内，由于正电荷相斥，也妨碍－螺旋的形成。天冬酰胺、亮氨酸的侧链很大，也会影响α-螺旋形成。脯氨酸的结构不利于形成－螺旋。形成β－折叠的肽段要求氨基酸残基的侧链较小，才能容许两条肽段彼此靠近。超二级结构（super-secondarystructure）

由RossmanM.G.于1973年首次提出。

是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。在蛋白质分子中特别是在球状蛋白质分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件（主要是α螺旋和β折叠片）组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合（combination）或二级结构串（cluster），在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构（super-secondarystructure）、标准折叠单位（standardfoldingunit）或折叠花式（foldingmotif）（3）超二级结构和结构域主要类型：αα、βαβ、βαβαβ、ββ、β-曲折、希腊结构、模体（α螺旋-转角-α螺旋、锌指、亮氨酸拉链）①

αα是一种α螺旋束，常由两股平行或反平行排列的右手螺旋互相缠绕而成的左手卷曲螺旋（coiledcoil）或称超螺旋

两股α螺旋的侧链能紧密相互作用，超螺旋结构更稳定纤维状蛋白质（如α角蛋白）的主要结构元件②

βαβ：最简单的βαβ组合又称βαβ单元β股平行α螺旋连接链③

βαβαβ：最常见的βαβ组合，三段β股和两段α螺旋又称Rossman折叠（βαβαβ）④

ββ：最简单的ββ超二级结构是β发夹

两个β股，一个短回环连接⑤

β-曲折⑥希腊钥匙拓扑结构模体：暂译为（

Motif

）在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，并发挥专一的功能。

如某些蛋白质中的α螺旋-转角-α螺旋、锌指、亮氨酸拉链和GTP结合活性的氨基酸序列。噬菌体λ噬菌体P22α螺旋-转角-α螺旋与DNA的结合钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构结构域（structuraldomain）多肽在二级结构或超二级结构的基础上组装而成的，多肽链折叠成近乎球状的组装体，这种相对独立的三维实体称为结构域（structuraldomain）或域（domain）是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。其意义：从结构角度上，为多肽链折叠成复杂的三级结构提供更为合理途径成为可能从功能角度上，由于结构域间的共价连接（连接肽，亦称“铰链区”）提供了两个结构域发挥作用的变构效应的可能主要类型：全α-结构、αβ结构、全β结构、小的富含金属或二硫键结构①全α结构反平行螺旋束，以回环相连整个多肽链折叠成两层α螺旋②α，β结构（以平行β片为基础）8+8③全β结构（以反平行β片为基础）闭合成桶④富含金属或二硫键结构小蛋白质（或结构域），很少量的二级结构。富含金属或二硫键对构象起稳定作用。富含金属或二硫键结构小蛋白质（或结构域），很少量的二级结构。富含金属或二硫键对构象起稳定作用是指由二级结构元件（α螺旋，β构象、β转角和无规卷曲等）构建成的总三维结构。换句话说，三级结构指多肽链上包括主链和侧链在内的所有原子在三维空间内的分布。（4）蛋白质的三级结构（tertiarystructure）N端肌红蛋白典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有8条α-螺旋。由多肽的折叠形成的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽链上的His残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O2结合）。C端由β-折叠、α-螺旋形成的结构域丙酮酸激酶的一个结构域免疫球蛋白的一个结构域球状蛋白质分子三维结构的共同特征

（1）含多种二级结构元件（结构单元）（2）具有明显的折叠层次（结构多层次）（3）致密的球状或椭圆球状实体（空间可塑性）（4）疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面（最稳定的三维结构）（5）球状蛋白质分子的表面有一个空穴（也称裂沟、凹槽或口袋）（结合配体）（5）蛋白质的四级结构（quaternarystructure）指蛋白质是以独立折叠的球状三维实体（亚单位、亚基）通过非共价键彼此缔合在一起构成蛋白质的四级结构亚基或称单体：指四级结构中每个独立的多肽（可以为一条肽链，也可以有多条肽链）。

具有完整的三级结构。通过二硫键连接的二条多肽链中一条多肽链？能视作亚基？单体蛋白质：只有一个亚基的蛋白质多亚基蛋白质：含有两个或多个亚基的蛋白质同多聚蛋白质：只由一种亚基组成的蛋白质；杂多聚蛋白质：由几种不同的亚基组成的蛋白质。原聚体：含两个或两个以上重复结构单位的多聚蛋白质都是旋转对称分子，这种重复结构单位称为原聚体血红蛋白质（α2β2）看成由二个原聚体（αβ）组成的对称二聚体结构蛋白质分子中的共价键与次级键共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构蛋白质的一二三四级结构2.5蛋白质结构与功能的关系蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。蛋白质的一级结构和三维结构均与其特定的功能相关。2.5.1一级结构与功能的关系种属关系—分子进化

蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。分子病（moleculardisease）基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降或丧失，就会产生疾病，这种病称为分子病。一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同。最早的序列分析：胰岛素蛋白质InsulinChainA:8-10位存在着不同（牛，ASV；猪，TSI；羊，AGV）（Brownetal.，1955）一级结构相似的蛋白质功能相似表-胰岛素的一级结构及种属差异

细胞色素c是由104个氨基酸组成的蛋白质。

比较50种不同的生物，凡与人类亲缘关系越远的生物，其氨基酸顺序与人类的差异越大。分子进化从细胞色素c的一级结构看生物进化

促肾上腺素皮质激素MSH促黑激素一级结构不同的蛋白质功能不同氨基酸组成变化改变其功能最早从分子水平证明的先天性遗传病，镰刀形红细胞贫血症（sickle-cellanemia）正常人血红蛋白β链的第6位氨基酸是Glu，而镰刀状细胞贫血病人的血红蛋白中，Glu变成了Val，仅此一个氨基酸之差，本是水溶性的血红蛋白，就聚集成不溶性的纤维束，并引起红细胞变形成镰刀状而极易破裂，产生贫血。β-链1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点含氧HbS脱氧HbS疏水位点血红蛋白分子凝集由较短肽链组成的蛋白质一级结构，其结构不同，生物功能也不同由较长肽链组成的蛋白质一级结构中，其中“关键”部分结构相同，其功能也相同；“关键”部分改变，其功能也随之改变。2.5.2构象与功能的关系别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。是蛋白质表现其生物功能的一种相当普遍而又十分重要的现象。

血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基的相互作用。

血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水袋形空穴，可结合一个血红素并携带1分子氧，因此1分子Hb共结合4分子氧。

Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。

Hb各亚基之间通过8对盐键，紧密结合成亲水的球状蛋白。

成人红细胞中Hb主要是由两条α肽链和两条β肽链组成（α2β2）。血红蛋白T型与R型互变血红蛋白氧合与脱氧构象转换示意图免疫球蛋白指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。基本结构是由两条相同的重链（heavychain，H链）和两条相同的轻链（lightchain，L-链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。2.6蛋白质的性质与分离技术蛋白质的性质蛋白质的分离和分析技术蛋白质分子中氨基酸序列的确定2.6.1蛋白质的性质蛋白质的相对分子质量蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的变性蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀反应蛋白质的颜色反应蛋白质的含量测定（1）蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10000~1000000之间。

测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

超离心法：蛋白质颗粒在25-50万g离心力作用下从溶液中沉降下来。

s=——vω2x沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。

v=沉降速度（dx/dt）

ω=离心机转子角速度（弧度/s）

x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）蛋白质分子量（M）与沉降系数（S）的关系M=—————RTSD（1－Vρ）R——气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——绝对温度D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V——蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1）S——沉降系数（2）蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。

血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同。＋白蛋白(A)α1α2βγ－（3）蛋白质的变性与复性天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性。变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。

有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。复性（renaturation）（4）蛋白质的胶体性质

蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之间，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等特性。蛋白质是高分子化合物，不易透过半透膜，因此可用透析法纯化蛋白质蛋白质为亲水性胶体，稳定的因素：颗粒表面电荷和水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（5）蛋白质的沉淀反应如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀:不稳定的蛋白质从溶液中析出结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱凝固：沉淀结块，结块不溶于强酸强碱尽量采用沉淀方式，保留蛋白质的活性，沉淀方法类别：

①高浓度中性盐（盐析、盐溶）②酸硷（等电点沉淀）③有机溶剂沉④重金属盐类沉淀⑤生物碱试剂和某些酸类沉淀⑥加热变性沉淀变性沉淀沉淀的蛋白质不一定变性，变性蛋白质不一定沉淀，但结絮、凝固是变性深刻化体现①盐析在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。蛋白质溶液为亲水溶胶体系其稳定因素：水化膜和电荷。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即形成沉淀。

不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。②加有机溶剂：破坏水化膜。③加重金属盐(pH>pI)H2N－Pr－COO－＋M＋H2N－Pr－COOM④加生物碱试剂(pH<pI)

单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。

＋H3N－Pr－COOH＋X－XH3N－Pr－COOH⑤加热可以使大多数蛋白质变性沉淀，是去除样品中蛋白质杂质的常用方法。（6）蛋白质的颜色反应N－OH①双缩脲反应红紫色络合物（碱性溶液）Cu2+CuSO4蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物Lorry法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

②Folin－酚试剂法Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。蛋白质定量、定性蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。③茚三酮反应（ninhydrinreaction）测定常用方法操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。①考马斯亮蓝法（Bradford法）（7）蛋白质的含量测定②

紫外吸收法由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。蛋白质质量浓度（mg/mL）＝1.45A280nm－0.47A280nm③

凯氏定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

CH2COOH

|

+3H2SO4

→2CO2+3SO2+4H2O+NH3

（1）

NH2

2NH3+H2SO4

→

（NH4）2SO4

（2）

（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3

（3）反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。2.6.2蛋白质的分离和分析技术主要是根据蛋白分子之间特异性的差异如溶解度，分子大小，电荷等建立。

透析和超滤----分子大小（胶体性质）

凝胶过滤----分子大小

盐析和有机溶剂沉淀----溶解度

电泳----两性解离性质

层析----对配体分子的生物学亲和力吸附性质（1）利用溶解度差别盐溶和盐析、

等电点沉淀和pH控制、有机溶剂分级分离法（2）根据蛋白质分子大小不同

透析和超过滤、凝胶过滤（3）根据电荷不同

电泳、离子交换层析（4）利用对配体的特异生物学亲和力

亲和层析法（5）利用选择性吸附

羟磷灰石层析、疏水作用层析在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响离子强度（I）Log（溶解度）盐溶：中性盐低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度。盐析：当蛋白质溶液的离子强度增加到一定强度后，很多蛋白质可以从溶液中沉淀下来。特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠作用原理：降低水的活度WaterActivity，水化层脱水，表面疏水基团暴露并相互作用引起聚集溶解度（蛋白mg/ml）等电点沉淀和pH控制：蛋白质在等电点状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。很少单独使用，可与盐析法和有机溶剂沉淀法结合使用有机溶剂沉淀法：与水混溶的右机溶剂如乙醇或丙酮去除蛋白质的水膜，同时，将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀。原理：降低溶液的介电常数，使蛋白质表面可解离基团的离子化程度减弱，有机溶剂脱去水化层，致蛋白质分子聚集而沉淀。介电常数大的溶剂，有利于离子对的解离。常用有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮缺点：常会使蛋白质变性注意事项：必须在低温下操作，尽量缩短处理的时间，及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去透析和超滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质分开。半透膜为玻璃纸或纤维素材料凝胶过滤：也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。电泳：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向移动称为电泳。带正电荷多蛋白紧密结合带负电荷多蛋白流过层析柱离子交换层祈法：当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强，随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附力从小到大的顺序先后洗脱下来。离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；即CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；即DEAE-纤维素）亲和色谱颗粒具有极强的专一性亲和层析法：是分离蛋白