凝胶过滤层析法分离蛋白质

实验一凝胶过滤层析法分离蛋白质1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理；2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。一、实验目的二、实验原理1.常用生化实验技术

分光光度技术电泳技术离心技术层析技术2.层析技术（色谱技术）

是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）建立起来的技术。（1）层析系统的基本组成

固定相+流动相固体物质/固定于固体物质的成分可以流动的物质：如水和各种溶媒待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相

由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的（2）层析法的分类

按两相所处状态分类

流动相液体气体固定相液体液—液层析法气—液层析法固体液—固层析法气—固层析法

按层析原理分类

名称原理吸附层析法固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力不同而分离分配层析法各组分在流动相和固相中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离亲和层析法固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同

按操作形式不同分类

名称操作形式柱层析法固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法平面层析法层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法（3）层析技术的优点

分离效率高分析速度快具有极高的灵敏度应用范围广适用：杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析3.凝胶过滤层析法

（gelfiltrationchromatography）（1）原理：

根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部，大分子物质被排阻在外。

又名分子筛过滤，排阻层析（2）凝胶的特点

属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。

交联葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶（3）凝胶的选择葡聚糖凝胶(商品名:Sephadex，Dextran)

型号:G-10–G-200多孔网孔结构数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小吸水能力，每g干胶吸水量的10倍SephadexG-50：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:1500–30000SephadexG-200：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:5000–80000例：B.琼脂糖凝胶

(商品名:Sepharose,Bio-gel–A)

对实验条件要求高(温度,pH)

＜40℃4.5-9.0

工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限,

用于大分子物质的分离C.聚丙烯酰胺凝胶商品名:Bio–gel–P（生物胶P）三、实验操作1.柱的选择直径：1~5cm

一般长度：直径=10：1~20：1

本实验玻柱：直径0.8~1.5cm

长度17~20cm2.凝胶选择、制备

血红蛋白溶菌酶分离（64500）（11400）选择SephadexG-50SephadexG-50：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:1500–30000制备：将干胶颗粒悬浮于5~10倍的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去3.凝胶装柱①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50开始下沉，至1~2cm时，打开出口③凝胶逐层上升，至顶部2-3cm时，关闭出口注意点：

垂直放置防止气泡产生防止柱的分层4.平衡放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）注意：防止床面干涸，可适当补充蒸馏水5.加样①加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露出床面时，立即关闭出口（将干未干）②用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面③打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出,

立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水6.洗脱当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸馏水，进行洗脱，直到两带分开检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，用试管分步收集洗脱液③10d/管，每管加NaOH2d，CuSO42d④检查