液相色谱概述与基本原理

液相色谱概述与基本原理主要内容色谱概述色谱法的定义与分类色谱法的分离原理色谱法中基本术语液相色谱法的分类及其分离原理定性定量计算概述色谱法的起源：俄国植物学家茨维特（Tswett）1901年发现利用吸附原理分离植物色素（a）加入样品溶液（b）加入洗脱液概述色谱法的发展史：1903年发表文章1906年Tswett创立“chromatography”-“色谱法”新名词1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管1931年奥地利化学家R库恩（RKuhn）分离出三种胡萝卜素异构体1935年adamsandholmes发明里苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱1938年izmailov发明了薄层色谱1941年martinandsynge发明了液-液分配色谱概述色谱法的发展史：1944年consden,gordonandmartin发明了纸色谱1952年martinandsynge发明了气-液分配色谱1954年ray发明了热导检测器1957年martinandgolay发明了毛细管色谱1959年porathandflodin发明了凝胶色谱1960年液相色谱技术完善色谱法的定义与分类色谱法的定义：色谱或色谱法也称之为色层发或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。将色谱分离技术应用于分析化学，成为色谱分析。色谱法的定义与分类色谱法的分类：按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱（GC）和液相色谱（LC）根据固定相的物态分：气-固色谱、气-液色谱、液-固色谱、液-液色谱按照使用的形式分类柱色谱、纸色谱、薄层色谱按照分离机理分吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱按照使用领域分类分析用色谱、制备色谱、流程色谱色谱法的定义与分类色谱法的特点（三高、一快、一广）：分离效率高应用范围广分析速度快样品用量小灵敏度高（适用于微量和痕量分析）分离和测定一次完成易于自动化色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）：高效液相色谱法是二十世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型的分离分析技术，目前已经成为应用非常广范的化学分离分析的重要手段，它是在经典液相色谱的基础上引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏的检测器，因而具备流速快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好的了解高效液相色谱仪的特点，我们从以下两个方面进行比较。色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与经典液相色谱法：高效液相色谱法比起经典的液相色谱法的最大的优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与经典液相色谱法：经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与气相色谱法：气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与气相色谱法：气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与气相色谱法：相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与气相色谱法：1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子，和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80%色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与气相色谱法：2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性色谱法的定义与分类高效液相色谱法（HPLC）与气相色谱法：3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）色谱法的原理基本理论热力学理论：塔板理论-平衡理论动力学理论：速率理论-vander方程色谱法的原理塔板理论：把色谱柱假想成一个分馏塔，由许多彼此独立的塔板组成，每一塔板的柱长为塔板高度（H）；在每一塔板内，一部分空间由固定相占据，另一部分由流动相占据，流动相占据的空间称为板体积（△V）；在每一塔板上，物质在流动相和固定相之间立即建立起分配平衡。色谱法的原理塔板理论方程：

该分配过程符合二项式分配定理(mS+mM)n展开式的系数项。由此可得，流出曲线方程同样根据流出曲线方程和二项式定理，可得到塔板理论方程，即H=L/n色谱法的原理塔板理论方程：

若扣除死时间（体积）的影响，得到有效塔板数（n’）和有效塔板高度(H’)：

它们比理论塔板数及高度，能更有效地反映色谱分离好坏与塔板数和塔板高度之间的对应关系。一般说来，色谱柱的理论塔板数越大，表示组分在色谱柱中达到分配平衡的次数越多，越有利于分离

色谱法的原理速率理论：注：色谱峰的总扩张等于各独立因素对扩张影响之和；色谱柱的总板高等于各独立因素对板高贡献之和，减少A、B/U、CU、三项的值，可以降低理论塔板高度，减少色谱峰的扩张，提高柱效。1涡流扩散项因为颗粒形状＆大小引起的2纵向扩散项（分子扩散）由浓度梯度引起的自由扩散3传质阻力项流动相和固定相之间的质量交换色谱法的原理涡流扩散：涡流扩散项：多径性引起扩张色谱法的原理涡流扩散：涡流扩散项（A）：根据上述公式，λ是和色谱柱中载体颗粒大小及分布、填充均匀情况有关的常数，粒度适中，粒度分布窄，λ值就小，所以A就小，柱效就高；dp是载体颗粒的平均直径，dp越小，A值越小，并且λ和dp之间要协调。色谱法的原理纵向扩散：色谱法的原理传质阻力：色谱法的原理速率理论方程：色谱法中基本术语液相色谱中常用的术语和参数：色谱图：各组分的浓度随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线，常称为色谱曲线图或色谱图。色谱法中基本术语液相色谱中常用的术语和参数：基线：没有样品进入检测器时，记录仪记录的是一条直线，这条直线称为基线。噪音：基线发生细小波动的现象。基线是在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的曲线。色谱峰高、色谱峰宽、半宽峰高（H）：指色谱峰最高点到基线的距离。峰宽（W）：在流出曲线拐点处做切线，分别于基线上相交两点，此两点间的距离叫峰宽。半宽（W1/2）：峰高一半处的色谱峰的宽度。由于色谱峰顶呈圆弧型，色谱峰的半峰宽并不等于峰宽的一半。色谱法中基本术语液相色谱中常用的术语和参数：保留值：表示被测组分从进样到色谱柱后浓度出现最大值时所需要的时间，叫做保留值。死时间（tm）：不被固定相吸收或吸附的物质通过色谱柱的时间死体积（vm）：色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统管道和检测系统的中体积，等于死时间乘以流动相的流速。保留时间（tr）：是被测组分从进样开始到色谱峰出现浓度最大的时间。等于组分在流动相中停留的时间+在固定相中停留的时间。调整保留时间（t’r）：保留时间减去死时间，实际上是组分在固定相中所滞留的时间。色谱法中基本术语液相色谱中常用的术语和参数：保留值：表示被测组分从进样到色谱柱后浓度出现最大值时所需要的时间，叫做保留值。相对保留值：在一定色谱条件下被测化合物和标准化合物调整保留时间之比：r’i,s=t’R(i)/t’R(s)

说明：r’i,s值越大，

色谱法中基本术语液相色谱中常用的术语和参数：容量因子（K’）：是在平衡状态下组分在固定相与流动相中质量之比，即K’=t’R/tM色谱柱的柱效率和分离度理论塔板数（n）：色谱柱的柱效率可以用理论塔板数（n）或理论塔板高度（H）来表示注：保留时间越长，Y或Y1/2越小，色谱峰越窄，理论塔板数越多组分在两相间达到分配平衡的次数越多，分离能力越强，柱效就越高。色谱法中基本术语液相色谱中常用的术语和参数：色谱柱的柱效率和分离度分离度（R）：又称分辨率是把柱效率和溶剂效率结合在一起的参数，是表示色谱柱在一定的色谱条件下对混合物综合分离能力的指标分离度、柱效率、容量因子之间的关系：液相色谱法的分类及其分离原理液相色谱中常用的术语和参数：液-固色谱法液-液色谱法离子交换色谱凝胶色谱液相色谱法的分类及其分离原理液-固色谱法（液-固吸附色谱法）各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂对不同成分之间吸附能力的差异而实现分离，固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相中的吸附作用的不同进行分配的。液-固吸附色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面存在着分散的吸附中心点。流动相中的溶质分子（X）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下的交换反应：

X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）

+nS（液相）其作用机制是溶质分子

X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂表面的竞争吸附。液相色谱法的分类及其分离原理液-固色谱法（液-固吸附色谱法）吸附反应的平衡常数是K与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关。K值较小：溶剂分子的吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。K值较大：表示该组分的分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。发生在吸附剂表面的吸附-解吸附平衡，就是液-固色谱分离的基础。液相色谱法的分类及其分离原理液-固色谱法（液-固吸附色谱法）a：吸附剂m：流动相Xm：流动相中的组分分子Xa：固定相中的组分分子Ym：流动相分子Ya：固定相中的溶剂分子吸附色谱图示意液相色谱法的分类及其分离原理液-固色谱法（液-固吸附色谱法）液-固色谱法中的吸附剂和流动相常用的液-固色谱法中的吸附机：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。注：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（氧化铝、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比K较小，保留时间较短，但是极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比K较大，保留时间较长。对吸附剂的要求：有较大的表面积和足够的吸附能力；对不同化学成分有不同的吸附能力，可以较好的把混合物分开；与流动相、溶剂及样品中的化合物不起反应；在所有的流动相和溶剂中不溶解；颗粒均匀，操作过程中不宜碎裂。液相色谱法的分类及其分离原理液-固色谱法（液-固吸附色谱法）流动相：溶剂纯度要高；试样要能溶于流动相中，且不同物质的K值不同；流动相的黏度要小；流动相不能影响试样的检测。常用的流动相有：甲醇、乙醚、乙腈、乙酸乙酯、吡啶。流动相的洗脱能力主要由其极性决定，极性强的流动相分子占据极性中心的能力强，洗脱能力就强，流动相的选择要依据样品的极性、吸附剂的活性而定。液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不同官能团的有机化合物或有机化合物不同的异构体。但液-固色谱法不宜用于分离同系物因为液-固色谱法对不同相对分子量的同系物的选择性不高。液相色谱法的分类及其分离原理液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液均匀涂渍在惰性物质表面（担体）作为固定相。液-液分配色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，主要是利用被分离物质在固定相和流动相中的溶解度差造成的分配系数的差别而被分离，在固定液中溶解度较小的组分很难进入固定相，在色谱柱中迁移速度较快。在固定液中溶解度较大的组分容易进入固相，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。液-液色谱法与液-液萃取法的分离原理相似，均服从分配定律

K=C固/C液注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温有关。K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。液相色谱法的分类及其分离原理液-液色谱法（液-液分配色谱法）

液-液分配色谱示意图液相色谱法的分类及其分离原理液-液色谱法（液-液分配色谱法）正向色谱和反相色谱正相分配色谱是用极性物质做固定相，非极性溶剂（苯、正己烷）做流动相。反相分配色谱是用非极性物质做固定相，极性溶剂（水、甲醇、乙腈）做流动相。注：正相色谱是固定相的极性大于流动相的极性，主要分离极性样品，极性弱的组分先被洗脱，极性强的组分后被洗脱；而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性，主要用于分离非极性和中等极性的化合物。液相色谱法的分类及其分离原理液-液色谱法（液-液分配色谱法）液－液分配色谱法的固定相常用的固定液为有机溶液，如极性的Ｂ、Ｂ氧二丙氰（ＯＤＰＮ），非极性的十八烷（ＯＤＳ）和异二十烷（ＳＱ）。注：涂渍的固定液容易被流动相冲走。采用化学键和固定相可以避免上述缺点，使固定液和担体之间形成化学键，如在硅胶表面进行硅烷化反应。形成ＳＩ－Ｏ－ＳＩ－Ｃ型键，把固定液的分子结合到担体表面图示：液相色谱法的分类及其分离原理液-液色谱法（液-液分配色谱法）液－液分配色谱法的固定相图示：注：化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。固定液上可结合不同的官能团，改善分离效能，固定液不溶于流动相，有利于进行梯度洗脱。液相色谱法的分类及其分离原理液-液色谱法（液-液分配色谱法）液－液分配色谱法的应用液－液分配色谱法既能分离极性化合物又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳环、稠环、染料、甾类化合物等，化合物中取代基中的种类和数目不同或化合物的相对分子量不同，均可用液－液分配色谱法进行分离。液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力而被分离。离子交换色谱法的作用机制聚合物的骨架上连接着活性基团，如：－ＳＯ３－、－Ｎ（ＣＨ３）３＋等为了保证离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负相反的离子Ｘ，称为反离子。液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱的过程，当交换达到平衡时：

K值越大，保留时间越长液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法m：流动相R：离子交换剂1：固定离子2：可交换离子阳离子交换树脂示意图液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法固定相和溶剂：固定相是具有网状立体结构的高分子聚合物，如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。固定相有两种类型：多孔型树脂与薄壳型树脂多孔型树脂：极小的球形离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大，缺点是机械强度不高，不能耐受高压。薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩，缺点是柱容量小，进样量不宜太多。液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法影响保留行为的因素溶质离子的价态和水合半径，价态高，K值大；同价离子，水合离子半径增大，K值小。常见阳离子在交换树脂上的交换顺序是：Fe3+＞AL3+＞Ba2+≥Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+≥Cu2+≥Co2+≥Mg2+≥Zn2+≥Mn2+＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+≥NH4+＞Na+＞H+＞Li+常见阴离子在交换树脂上的交换顺序是：柠檬酸根＞PO43-＞SO42-＞I-＞NO3-＞SCN-＞CL-＞HCO3-＞CH3COO-＞OH-＞F-液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法影响保留行为的因素离子交换剂的交联度与交换容量：在一定的范围内，树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分的保留时间越长。流动相的组成和pH值：交换能力强的离子组成的流动相具有较强的洗脱能力，强离子交换树脂的交换容量不随流动相的pH变化，调节pH值得作用主要是控制弱电解质的解离。液相色谱法的分类及其分离原理离子交换色谱法离子交换色谱法的应用主要用来分离离子或可解离的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换法进行分离。广泛应用于：无机离子，有机化合物和生物离子（氨基酸、核酸、蛋白质等）液相色谱法的分类及其分离原理凝胶色谱法（空间排阻色谱法）凝胶是一种多孔性的高分子聚合物，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的的。凝胶色谱法的作用机制：体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱。小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱。中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介于上述两种情况之间。液相色谱法的分类及其分离原理凝胶色谱法（空间排阻色谱法）凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析的方法液相色谱法的分类及其分离原理凝胶色谱法（空间排阻色谱法）凝胶色谱法的固定相和流动相：固定相是多孔凝胶，选择时使试样的分子量落入排斥极限和全渗透点之间。平均孔径：凝胶孔径的大小排斥极限：不能渗透进入任何凝胶孔径的物质的分子量。流动相：对流动相的溶解性好，且能润湿凝胶；溶剂的黏度要低，否则会限制分子扩散影响分离效果；一般水溶性试样选水溶液，非水溶性的试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。液相色谱法的分类及其分离原理凝胶色谱法（空间排阻色谱法）凝胶色谱法的应用特点保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子量大的化合物，相对分子量在400-8*105的任何类型的化合物。保留时间段，色谱峰窄，容易检测。固定相遇溶质分子的作利用力极弱，趋于零，柱的寿命长。不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上才能得到分离。液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法的选择运用范围高效液相色谱法是常温下进行分离与分析，不会导致被测物质的分解，其流动相是液体，所以只要试样能够制备成溶液，原则上都可以用液相法进行分离和分析，如离子型化合物，不稳定的天然化合物以及氨基酸、蛋白质等到分子化合物均可以用高效液相法得到好的分离效果。液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法的选择选择的依据定性定量计算色谱定性、定量计算色谱定性的鉴定方法：利用纯物质定性的方法利用保留值定性，通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。注：不适用于不同仪器上色谱图数据之间的比较。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化，如果混合后峰高而半峰宽并不相应增加，则表示两物质很可能是同一物质。利用双柱法测定：不同物质有可能在同一色谱柱上具有相同的保留，所以应该采用两根或多根性质不同的色谱柱进行分离，观察未知物和标准试样的保留值是否重合。定性定量计算色谱定性、定量计算色谱定性的鉴定方法：利用文献的保留值定性采用相对保留值定性：相对保留值至于固定液和柱温有关，所以只要保证这两项与文献一致即可，色谱手册中均列有各物质在不同固定液上的保留数据，可以用来定性鉴定。根据保留指数定性是一种重现性好的定性方式，有称kowats指数，只要保证所选固定相与柱温与文献一致。定性定量计算色谱定性、定量计算色谱量分析方法：在一定的操作条件下，分析组分i的质量mi及其浓度与检测器的相应信号（色谱图上表现为峰面积Ai或峰高Hi）成正比。即mi=fi*Ai这就是色谱定量分析的依据由此可见在定量分析中需要：准确测量峰面积Ai或峰高Hi；准确求出比例常数fi（称为定量校正因子）；正确选用定量计算方法，将测定组分的峰面积转换成质量。峰面积的测量：通过软件，选择合适的积分条件