组织培养基本技术

第三章

细胞培养的基本技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。基本操作技术和要求培养室的无菌操作：培养前准备：培养室和超净台的消毒：洗手和着装：无菌培养操作：

培养前准备

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。基本操作技术和要求培养室和超净台的消毒

无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min.

超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。洗手和着装

原则上和外科手术相同。开始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进行原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

培养过程中的无菌操作

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。

进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

第一节

培养细胞的取材与分离一、培养细胞的取材：1、原代取材的基本要求：无菌取材取材器械要锋利及时培养剔除与培养细胞无关的成分营养要丰富采用易培养的组织进行培养注意保存原代组织的相关材料及信息2、取材的基本器材和用品眼科组织弯剪、弯镊、手术刀装有无血清培养基或Hank’s液的小瓶小烧杯、培养皿3、不同组织的取材①皮肤和粘膜的取材取材目的：获取上皮细胞（主），成纤维细胞取材方法：手术过程切除的部分组织；如有特殊需要可单独取材（2～3mm2）注意事项：严格消毒；不用碘酒消毒；要获取上皮细胞，取材时不要切取太厚，如欲培养成纤维细胞则反之。②内脏和实体瘤的取材取材目的：获取各脏器细胞及瘤细胞取材方法：明确和熟悉所需的组织类型和部位，去除不需要的部分如血管、神经和结缔组织；尽可能取肿瘤细胞分布较多的部分，避开坏死液化部分。注意事项：③血细胞的取材取材目的：白细胞----用于染色体分析、淋巴细胞体外激活进行免疫治疗等。取材方法：静脉取血（微量时，指尖或耳垂）注意事项：加入肝素抗凝（量适宜，过大导致溶血）抽血要严格无菌。④鼠胚组织的取材取材目的：取材方便，易于培养，与人类相近，是较常用的培养材料。取材方法：断颈处死，75%酒精消毒5min，固定，解剖取材注意事项：保证无菌消毒浸入75%酒精时间不能太长，以免酒精入口消毒后的操作应在超净台或无菌环境中进行⑤鸡胚组织取材取材目的：用于分离培养禽类病毒以进行疫苗的生产取材方法：选用9～12d的鸡胚，无菌条件下剪开气室端蛋壳，切开蛋膜，用小镊子挑起鸡胚，放到无菌培养皿中取材。注意事项：在无菌条件下操作。二、组织材料的分离目前分散组织的方法有机械法和化学法两种。1、细胞悬液的分离方法：培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，500～1000r/min低速离心5～10min。2、组织块的分离方法：机械分散法：对一些纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织。剪切分离法：组织块移植培养。消化分离法：获得细胞悬液直接培养。①机械分散法的步骤：先用Hank’s液或无血清培养液漂洗组织，剪成5～10mm3的小块，置80目孔径的筛网，用注射器针芯轻压组织，使之压碎并通过纱网。吸管吸出组织悬液，置150目筛中，步骤同上。镜检计数，接种。（组织过大，用400目筛）。②剪切分离法的步骤：冲洗的组织块放在小烧杯中，用眼科剪反复剪至糊状。加入Hank’s液或无血清培养液，反复轻轻吹打。低速离心去上清液，剩下组织小块即可培养。③消化分离法消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法。消化后组织松散、细胞分开，细胞容易生长，成活率高。常用的方法：胰蛋白酶消化法胶原酶消化法A、胰蛋白酶消化法：细胞间质少的软组织组织剪成1～2mm3的小块或糊状，吸到三角烧瓶或培养瓶，加入预温到37℃的胰蛋白酶。（也可在4℃冰箱中冷消化12～24h），放入37℃水浴或温箱中20～60min。消化好后用Hanks液漂洗，去除胰蛋白酶，用培养液重悬细胞，计数、接种。B、胶原酶消化法：将漂洗修剪干净的组织剪成1～2mm3的小块，放到三角烧瓶，加入3～5倍体积的胶原酶，密封烧瓶，放入37℃水浴或温箱（恒温振荡水浴箱）中4～48h，收集消化液，1000r/min离心5min，弃上清液，用培养液重悬细胞，计数、接种。第二节

原代培养技术原代培养概念：是从供体取得组织细胞后在体内进行的首次培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的细胞生物学特性未发生很大变化，适合做药物测试、细胞分化等实验研究。原代培养的方法：组织块培养法消化培养法一、组织块培养法概念：是将组织剪切成小块后，接种于培养瓶进行培养。（组织量少的原代培养）特点：简便易行，成功率较高。操作：取材修剪冲洗剪切成1mm3小块；移入培养瓶；分布组织小块间距5mm；翻转培养瓶并加培养液37℃静置2～4h；翻正培养瓶进行培养；观察原代细胞生长。二、消化培养法概念：组织通过消化分散法制成细胞悬液，接种、培养。（适合培养大量组织）优点：较短时间可获得大量活细胞。缺点：步骤多，易污染，成本高。操作：按消化分离法获取细胞；镜下观察见组织已分散，终止消化；200目筛网滤过组织块；收集的消化液800～1000r/min离心5min；去上清，加含血清培养基制成细胞悬液；计数，接种于培养瓶。.动物细胞培养过程第三节

细胞传代培养技术一、原代培养的首次传代传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程，称为传代。注意：首次传代非常重要。细胞生长到足以覆盖瓶底大部分表面后再传代。传代时不同的细胞有不同的消化时间，注意观察，及时处理。首次传代时细胞接种数量要多；随消化分离而脱落的组织块也一并传入新的培养瓶。二、细胞传代方法传代方法：贴壁细胞：消化传代法。半悬浮生长细胞：吹打传代。悬浮细胞：直接吹打或离心沉淀后再分离传代。二、细胞传代方法贴壁细胞传代步骤：吸弃或倒掉瓶内陈旧培养基；加适量消化液，轻晃培养瓶，是消化液流遍所有细胞表面；消化2～5min，镜下观察见细胞质回缩、细胞间隙增大，终止消化；加少许含血清培养基，用吸管吹打；计数，接种到新的培养瓶。二、细胞传代方法悬浮细胞传代步骤：直接传代：细胞沉淀、吸掉多半上清液、吹打、传代。离心传代：（常用此法）细胞及培养液吸到离心管内；800～1000r/min离心5min，弃上清液；加新的培养基，吸管吹打，然后传代接种。半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。三、细胞系的维持细胞系的维持：就是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存来实现。注意：做好细胞系的档案记录工作；遵从细胞生长的规律；多种细胞系维持传代，要严格操作程序，防止细胞间交叉污染；及时冻存。四、培养细胞的纯化细胞的纯化方法：自然纯化和人工纯化。自然纯化：利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化。不能人为选择细胞。三、培养细胞的纯化细胞的纯化方法：人工纯化：利用人为手段造成对某一种细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长，从而达到细胞纯化。方法有酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法。第四节

细胞冻存、复苏和运输技术一、细胞的冻存冻存的意义：节省人力和物力、维持原代细胞的特性。在制备单克隆抗体时，为保证杂交瘤细胞不致因传代污染或因变异而丢失，应及时冻存。购买的细胞株，经过1～2次稳定传代，及时冻存。冻存的原理：低温冷冻（-196℃）为最大限度的保存细胞活力，细胞冻存及复苏基本原则是慢冻快融。当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果冷冻速度过快，形成的结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。而缓慢冷冻可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。使用浓度范围在5～15%之间。细胞冻存步骤：取生长状态好的细胞消化制成细胞悬液离心洗涤加含有10%DMSO冻存液混匀，移到冻存管（或安瓿）封口，做好标记，4℃40～60min，-20℃20～40min，

-70℃过夜第二天放在液氮管，记录。二、细胞的复苏细胞复苏应采用快速融化：快速融化使细胞顺利通过最易受损的-5～0℃，保证细胞外结晶在短时间内融化，避免缓慢融化时水分渗入细胞内再结晶，对细胞造成损害。复苏失败的原因：冻存细胞数量少或生长状态差细胞污染液氮不足复苏时，培养条件改变复苏方法不当二、细胞的复苏细胞复苏步骤：从液氮罐取出细胞，迅速放到37℃水浴中。融化后，取出冻存管，消毒开盖液体移到离心管，添加培养液，1000r/min离心5min除去上清液，用培养液稀释，计数、接种。三、细胞的运输细胞运输的方法：冷冻储存运输：液氮冻存运输：充液法：长距离运输（几天）：选择生长好的细胞，充满液体，封口，棉花包裹，到达目的地，吸去多余液体。短距离运输（几小时）：细胞悬液空运：第五节

培养细胞的观察和检测技术一、培养细胞的常规观察1、培养液：直接用肉眼观察培养液的颜色和透明度的变化。清亮透明，如出现混浊多为污染（悬浮细胞培养除外）。颜色变化：桃红色，变黄表明代谢物增多，需要换液或传代处理。培养液很快变黄：可能原因有细菌污染、培养器皿没洗干净，有残留物、细胞接种密度较大。2、细胞生长情况：倒置显微镜观察，细胞均需要经过一段适应期或潜伏期（时间长短不同）才增殖。原代培养最先见从组织边缘“长出”细胞传代的细胞潜伏期短，开始生长后很快进入指数生长期，长满瓶底的80%，及时传代。3、细胞形态变化：镜下观察到细胞透明度大、折光性强、轮廓不清，表明细胞生长状态良好。用相差显微镜观察细胞的细微结构。观察到细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中出现空泡、脂滴、颗粒样物质细胞间隙增大，变得不规则，表明细胞生长状态不良。如果观察到细胞从瓶壁脱落、崩解、漂浮，表明细胞生长状态很差，要查明原因，采取措施。4、微生物污染：微生物污染包括细菌、霉菌、酵母菌、支原体等。细菌、霉菌、酵母菌污染最典型的表现为培养液浑浊，液体内漂浮菌丝或细菌。传代稳定、生长规律的细胞系，如果培养条件不变而细胞生长明显缓慢、胞质内颗粒增多，但培养基多不发生浑浊，考虑支原体污染。污染多发生在传代、换液和加药等操作之后。在这些操作之后的24～48h密切注意有无污染。二、细胞生长状况的观察1、细胞计数：细胞计数是细胞培养研究中的一项基本技术。血球计数板计数法和电子细胞计数仪计数法。步骤：准备计数板：95%酒精消毒，拭干制备细胞悬液加样计数：10×物镜、四角大方格中细胞计算：细胞数/毫升数=（四大格细胞数之和/4）×1041、细胞计数：细胞密度换算：c1×v1=c2×v2配制10ml106个细胞/ml细胞悬液，现有108个细胞/ml的细胞悬液，如何稀释？

108×v1=106×10mlv1=0.1ml

吸取0.1ml108个细胞/ml的细胞悬液，补加9.9ml培养基即可。注意事项：取样计数前充分混匀计数时，如见2个以上细胞组成的细胞团，记为一个，细胞团占10%以上，说明消化不充分四大格的数目相差8个以上，表示细胞分布不均。2、细胞生长曲线：测定细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。在细胞系细胞和非建系细胞的生长特性观察中，其为最基本的指标。方法：取生长状态良好的细胞，消化，计数，调整密度接种细胞于培养瓶（30个）或24孔培养板（2块）每天取3瓶（孔）细胞消化，计数，计算平均值，10d培养时间为横轴，细胞数为纵轴，汇出曲线。2、细胞生长曲线：结果分析：标准的细胞生长曲线近似“S”形。细胞倍增时间是在生长曲线上细胞数量增加1倍的时间。细胞群体倍增时间：作图法和公式法

DT=t×lg2/lgnt-lgn0说明：接种细胞数不能过少也不能过多反映数值不够精确，可有20～30%的误差通过对生长曲线的绘制，了解细胞适合生长的培养基3、细胞分裂指数：分裂细胞占全部细胞的比例，用来表示细胞增殖旺盛程度。一般计算1000个细胞中的细胞分裂相数方法：消化，计数，调整密度接种到放置有小盖玻片的培养瓶内每24h取出一个盖玻片，按常规方法95%酒精固定，吉姆萨或HE染色、封片镜下计数（细胞密度多、中、少三个区域）连续计数，可绘制细胞分裂指数曲线图三、细胞培养的污染检测和排除培养细胞的污染：包括微生物污染以及所有混入培养环境中的对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物污染。污染种类：微生物：真菌、细菌、病毒和支原体化学物质：细胞：非同一种细胞1、微生物污染：①污染途径：空气：最主要途径。工作时减少空气流动是防止污染的重要环节。器材：清洗消毒不彻底操作：无菌观念不强，动作不准确，操作不规范等血清：生产时已污染组织样本：原代培养的污染②污染对细胞影响：③污染检测和排除：A、真菌污染和排除：种类很多：烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、酵母菌、白念珠菌肉眼见培养液形成白色或黄色漂浮物镜下可见细胞之间有交错的丝状、管状及树枝状的菌丝采用制霉菌素25μg/ml或酮康唑10μg/ml白色念珠菌污染B、细菌污染和排除：常见的污染菌有：大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等肉眼见培养液短期内颜色变黄，明显浑浊镜下可见培养液中有大量圆球形颗粒漂浮，必要时，可取少量培养液涂片染色检查采用联合抗生素细菌污染C、支原体污染和排除：支原体是一种大小介于细菌和病毒之间并独立生活的微生物。无细胞壁，形态高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。支原体污染的检测：相差显微镜：直接观察和低渗溶胀处理地衣红染色观察荧光染色法：Hoechst33258电镜观察DNA分子杂交检查或支原体培养支原体污染C、支原体污染和排除：支原体污染的排除：抗生素处理：四环素类、大环内酯类：高热处理：41℃作用5～10h：巨噬细胞和抗生素联合处理：鼠的传代处理：血清处理：2、细胞交叉污染及排除：防止交叉污染的措施：①实验器材如吸管不能混用②培养用液公用时，细胞吸管和细胞用液管要分开，以防将细胞带到培养用液中。③实验的细胞要及时冻存。3、化学物质污染及排除：化学污染物质包括：①残存洗涤剂；②细胞残余；③解体的微生物等。防止化学物质污染的措施：实验所有器材都要严格清洗和灭菌消毒，并正确掌握器材操作要领。四、干细胞

干细胞（stemcell）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可通过分裂维持自身细胞的特性和大小，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用。概念干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域。

1999年干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。

组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。（一）概述干细胞有几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞；干细胞能无限增殖分裂；干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。干细胞的分类全能干细胞多能干细胞单能干细胞按分化潜能按发育状态胚胎干细胞成体干细胞根据干细胞组织发生的名称进行分类胎胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（ES细胞）。多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经干细胞。单能干细胞：只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。胚胎干细胞

ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。成体干细胞

成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。

1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡（1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。