谷丙转氨酶活性的测定

谷丙转氨酶活性的测定实验目的1.掌握谷转氨酶活性测定的原理和方法2.了解转氨酶在生物体内的重要作用实验原理1.转氨酶能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基进行相互转化，生成新的氨基酸和新的酮酸，这一过程称为转氨基作用。2.动物体内含量最多的是谷草转氨酶GOT和谷丙转氨酶GPT。GPT在肝脏内含量丰富，血清内含量极少，但当肝脏受损时，酶从肝细胞释放，血清内GPT含量升高。GPT能催化的反应如右:丙氨酸+酮戊二酸→谷氨酸+丙酮酸3.丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，该物质在碱性溶液中显棕红色，利用分光光度计测定该棕红色物质的吸光度值，间接测定丙酮酸的含量，并制作标准曲线。试剂与器材分光光度计水浴锅血清NaoH溶液1.试剂0.1mol∕L磷酸盐溶液GPT基质液2,4-二硝基苯肼溶液2μmol/ml的丙酮酸标准液75%的乙醇2.器材烧杯移液管胶头滴管容量瓶玻璃棒比色杯电子天平试管及试管架洗耳球等操作步骤一.血清的提取1.电子天平称量小鼠体重，用75%的乙醇按一定比例对小鼠进行灌胃。灌胃时要紧贴上颌，将针头轻轻旋入胃中，一边观察小鼠精神状态一边缓缓注入一定体积的乙醇。2.24h后，摘除小鼠眼睛，于眼部取血至离心管。3.3500r∕min离心5分钟，用移液枪移去上清液到另一离心管，离心2次。操作步骤二.标准曲线的制作1.取6支试管，标记后按表1加入溶液ml试剂管号123456磷酸盐缓冲液0.100.100.100.100.100.10GPT基质液0.500.450.400.350.300.25丙酮酸标准液00.050.100.150.200.25操作步骤2.混匀后，置37度水浴预温5min，分别加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5mol，混匀，保温20min,各加0.4mol∕mL的NaoH溶液5ml，混匀，室温放置10min。3.在520nm波长下，以1号管调零，用分光光度计测各管吸光度值。4.以丙酮酸的含量(微摩尔)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。操作步骤三.GPT活力的测定1.取3支试管，标记后按表2加入溶液ml试剂空白管对照管样品管磷酸盐缓冲液0.02GPT基质液0.10.1（37度保温30min)0.1血清0.022,4-二硝基苯肼0.10.10.1血清0.02（混匀后37度保温20min）0.1mol∕mLNaoH111操作步骤混匀各管，室温放置10min。分光光度计在520nm下，空白管调零，测各管吸光度值。2.用样品管的吸光值减去对照管的吸光值，得出吸光值之差。借助标准曲线，求出该差值对应的丙酮酸微摩尔数。3.血清GPT活力计算。转氨酶活力单位可表示为：每100ml血清中GPT的活力单位数。实验结果实验数据记录-表3试管号123456丙酮酸标准液（2μmol/ml）00.05ml0.10ml0.15ml0.20ml0.25ml吸光值00.0690.1770.2000.2820.355实验结果实验结果实验数据-表4空白管对照管样品管吸光值0.3290.0050.278实验结果吸光值之差=0.278-0.005=0.273代入标准曲线经计算的丙酮酸浓度为0.64μmol/ml→0.02ml