食品酶学绪论

食品酶学第1章绪论主要内容1.1酶的定义与特征1.2酶学研究简史1.3酶的分类和命名1.4酶学对食品科学的重要性1.1酶的定义与特征1.1.1酶的定义酶是由生物活细胞所产生的、具有高效和专一催化功能的生物大分子。（1）高效性同一反应，酶催化反应的速度比一般催化剂催化的反应速度要大107～1013倍。有极少量酶就可催化大量反应物发生转变。1.1.2酶的特征例如，铁离子和过氧化氢酶都可以催化双氧水（H202）分解成为水和氧气。在一定条件下，1mol铁离子可催化6×10-4mol双氧水分解。在相同条件下，1mol过氧化氢酶却可催化5×106mol的双氧水分解。过氧化氢酶的催化效率达到铁离子的1010倍。（2）酶的专一性一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。①绝对专一性这类酶对底物的要求很严格，甚至有时只能催化一种底物，进行一种化学反应。例如：过氧化氢酶只能催化过氧化氢的分解。琥珀酸脱氢酶只能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。②

相对专一性有些酶要求底物具有一定的化学键，对一类底物起作用，催化一类反应。例如：淀粉酶只能催化淀粉糖苷键的水解；蛋白酶只能催化蛋白质肽键的水解。③

立体异构专一性几乎所有的酶对于立体异构体都具有高度的专一性。即酶只能催化一种立体异构体发生某种化学反应，而对另一种立体异构体则无作用。例如：L-氨基酸氧化酶只能作用于L-氨基酸。乳酸脱氢酶能催化L-乳酸脱氢变为丙酮酸，对D-乳酸则无作用。（3）高度受控性无论在体内或体外，酶的催化活力都受到多种因素的调节和控制。如基因表达、辅助因子、存在状态、反馈抑制、底物水平、激素水平、激活剂、抑制剂、温度、pH、酶原激活等。（4）易变性大多数酶是由生物活细胞产生的有催化能力的蛋白质，只要不是处于变性状态，无论是在细胞内还是细胞外都可发挥催化作用。紫外线、热、表面活性剂、重金属盐以及酸碱变性剂等能使蛋白质变性的因素，往往也能使酶失效。酶本身能被水解蛋白质的蛋白质水解酶分解而丧失活性。（5）代谢相关性生物体内几乎所有的新陈代谢反应都需要酶的参与，对酶的任何改变都会影响甚至改变该酶参与的生物代谢过程。1.1.3食品酶学的定义酶学是研究酶的性质、酶的作用规律、酶的结构和作用原理、酶的生物学功能及酶的应用的一门科学。食品酶学是酶学的基本理论在食品科学与技术领域中应用的科学，是酶学的重要分支学科。主要研究食品原理、食品产品中酶的性质、结构、作用规律以及对食品储藏、加工和食用品质的影响，食品级酶的生产及其在食品储藏、加工等环节的应用理论与技术。1.2酶学研究简史酶学重要性化学医学生物工程生理学微生物学生物化学酶轻工、化工食品、医药能源、环保1.2.1人类利用酶的催化作用的历史悠长而久远⑴远在进入游牧生活时期，人类已开始利用动物的胃液（含凝乳酶）来凝固牛乳，制造干酪。⑵中国早在4000年前的夏禹时代就已掌握了用麴和蘖酿酒的技术。《书经》中有“若作酒醴，尔维麴蘖”的记载。⑶在周朝（3000多年前），中国人民就会利用麦曲将淀粉降解为麦芽糖制造饴糖。(4)约2500年前的春秋战国时期，人们已懂得利用酒曲来治疗肠胃病，用鸡内金（鸡胃膜）治疗消化不良。⑸人们还利用粪便使兽皮脱毛，制作皮革；用胰脏软化皮革，这些都属于酶的作用。1.2.2酶的发现（1）1833年法国化学家Payen和Persoz从麦芽汁提取物中首次发现了淀粉酶。（2）到19世纪中期，科学家们已陆续发现了胃蛋白酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和转化酶等。

巴斯德主张：发酵和活细胞有关，酒精发酵是酵母细胞生活的结果。巴斯德（1822-1895）微生物学的奠基人提出分子不对称性理论，开创了立体化学研究的途径。创立了发酵的生物学理论，低温消毒技术（巴氏杀菌）免疫学--预防接种，研制出狂犬疫苗李比希认为：发酵及其他类似过程，是由于化学物质的作用，纯粹是化学过程。李比希(1803—1873)德国化学家化学教育改革家有机化学创始人农业化学之父（3）关于发酵本质的长期论战从1901年到1910年最早的十次诺贝尔化学奖获得者中，李比希的学生就有七位。（4）1897年，毕希纳两兄弟(EduardBuchner&HansBuchner)成功的从酵母细胞分离出具有发酵作用的物质，能使糖发酵。这说明巴斯德和李比希的两种观点实质上是一致的。生物化学就是在解决发酵本质的著名论战中产生的。HansBuchner（1850-1902）德国细菌学家EduardBuchner(1860-1917)1907年诺贝尔化学奖Enzyme的词源1878年，德国科学家Kuhne首先提出用以表示未统一名称的已知的各种酵素——enzyme。Enzyme本身的意思是“在酵母中”，起源于希腊语，其中en表示“在之内"，zyme表示酵母。1.2.3酶催化的专一性

1894年，Fischer提出了“锁和钥匙”模型，成功解释了酶的催化反应机制。1959年，Koshland提出的“诱导契合”理论，以解释酶的催化理论和专一性，同时也搞清了某些酶的催化活性与生理条件变化有关。1902年，Henri提出了酶与底物作用的中间复合物学说。1913年，Michaelis和Menten提出中间产物学说，推导出酶促反应动力学方程，即著名的米氏方程：

V=Vmax[S]/Km+[S]1.2.4酶学的理论研究1926年，美国人Sumner首先从刀豆中获得了不负载任何其他催化剂的脲酶结晶，证明脲酶具有蛋白质性质。1930年至1936年间，制取了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶。从此确立了酶的化学本质是蛋白质的观点，为酶的理化特性研究奠定了基础。1960年，操纵子学说的提出阐明了酶生物合成的基本调节机制。1965年，Philips首次用X射线晶体衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构，为以后酶结构、功能以及催化机制的研究奠定了良好的基础。20世纪80年代，Cech和Altman分别发现了具有催化功能的RNA-核酶，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域。1.2.5酶的固定化1953年，德国科学家Grubhofer和Schleith首先将聚氮基苯乙烯树脂重氮化，将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶结合在树脂上，制成固定化酶，有效地进行了酶的固定化研究。1969年日本的千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。美国在20世纪70年代初开始采用固定化酶技术，使玉米淀粉经酶法液化、糖化和异构化后，成功地工业化生产第一代、第二代和第三代高果糖浆，代替蔗糖作为可口可乐和百事可乐等饮料食品的甜味剂，提高了饮料质量，是一项非常成功的技术创新。1971年，出现了固定化菌体技术，70年代后期人们开始运用固定化细胞技术生产胞外酶。80年代中期，固定化原生质体技术则被用于生产胞内酶，以去除细胞壁扩散的障碍。酶固定化技术的发展也引起了食品、发酵工业一场大变革。目前为止，已发现自然界存在的酶有3000多种，但真正形成工业规模生产的只有几十种。1.2.6酶工程的发展

酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。1969年，日本的千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸后，学者们开始用“酶工程”这个新名词来代表有效地利用酶的科学技术领域。而近20多年来，在酶和细胞固定化技术发展的同时，其他酶分子修饰技术也在不断发展进步。此外，酶的化学合成、人工模拟，以及各种酶的应用技术研究，使酶工程不断向广度和深度发展，显示出广阔而诱人的前景。1.2.7基因工程技术对酶学的影响20世纪80年代基因工程技术诞生以来，对酶学的研究与应用技术也产生了深刻的影响。基因工程技术不但促进了基础酶学的研究，如酶基因的克隆、酶催化机理的研究等，同时也促进了酶在食品工业中的应用，奠定了现代食品酶学的重要发展方向。1.3酶的分类和命名1.3.1酶的命名及面临问题1833年Payen和Persoz发现麦芽提取液的酒精沉淀物中包含一种热敏性物质可将淀粉水解变为糖，由于其能从不可溶的淀粉颗粒中分离出可溶性的糊精，他们将此物质命名为“diastase”，意思是“分离”（中文现译为“淀粉酶”），这样随意的方式成为酶命名的开端，后来命名一种酶时常加词尾“ase”。在随后的很长一段时间里，出现了各种各样的命名方式。有根据纯化后酶的颜色来命名的，如老黄酶（oldyellowenzyme）；有根据酶的来源命名的，如无花果蛋白酶（ficin），胃蛋白酶（pepsin）；有根据酶作用的底物来命名的，如果胶酶（pectase）。问题：命名混乱；一酶数名或一名数酶；不能体现酶所催化反应的特性；1.3.2酶学委员会提出的命名规则酶学委员会提出以酶所催化的化学反应性质作为酶的分类和命名规则的主要依据，每一种酶都给以三个名称：惯用名，系统名和一个数字编号。惯用名不需要非常的精确，要求比较简短，使用方便；一般根据酶所作用的底物名称、催化的反应性质、酶的来源或其他特点来进行命名。系统名要求能确切地表明底物的化学本质及酶的催化性质；包括两部分，底物名称及反应类型；若酶催化的反应中有两种底物起反应，则这两种底物均需表明，当中用“：”隔开。若底物之一是水时，可将水略去不写。例：多酚氧化酶其系统名称为：1,2-苯二酚：氧-氧化还原酶。数字编号系统根据酶所催化反应的类型将酶分为6大类，并以4个阿拉伯数字来对每一种酶进行编号。例如乙醇脱氢酶，编号为EC1.1.1.1。EC是指酶学委员会（EnzymeCommission）。第一个数字代表酶的6个大分类，以1，2，3，4，5，6来分别代表如下6大酶类：（1）氧化还原酶（Oxidoreductases）催化氧化还原反应；（2）转移酶（Transferases）催化分子间基团转移的反应；（3）水解酶（Hydrolases）催化水解反应；（4）裂合酶（Lyases）催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应；（5）异构酶（Isomerases）催化分子的异构反应；（6）合成酶（synthetases）催化两分子连接的反应。1.3.3同工酶的命名

同工酶是指在生物体内或组织中催化相同反应而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空间结构等）的酶。国际生化协会同工酶分委员会建议同工酶的名称根据他们在电泳中分离的位置确定，从电泳中向着阳极移动最远的酶开始依次编号。1.4.1酶对食品加工和保藏的重要性（1）控制食品原料中的酶活力有效改善食品原料的风味和质地结构（2）利用酶的催化活性进行食品加工及保藏1.4酶学对食品科学的重要性葡萄糖氧化酶作为除氧剂普遍应用于食品保鲜及包装中，延长食品保质期。溶菌酶在食盐、蔗糖等溶液中稳定，耐酸耐热性强，是天然安全的食品防腐剂。1.4.2酶对食品安全的重要性（1）通过基因工程手段改造部分微生物基因，改变酶蛋白的基本结构，达到强化酶在某方面功能特性的做法给食品酶的应用带来安全隐患。（2）酶作用会使食品品质特性发生改变，有可能会产生毒素和其他不利于健康的有害物质。如果将加入食品中的酶看作为食品添加剂，那么就应该考虑到卫生和安全方面的问题。（3）利用酶法解毒。例如，利用乳糖酶预先处理乳制品，可以有效缓解或消除人体因消化乳糖困难而引起的胃胀气、腹痛、呕吐或拉肚子等症状。1.4.3酶对食品营养的重要性（1）酶作用有可能导致食品中营养组分的损失。（2）利用酶作用去除食品中的抗营养素，提高食品的营养价值，使食品中的营养元素更利于人体的吸收利用。1.4.4酶对食品分析的重要性酶法分析具有准确、快速、专一性和灵敏性强等特点，其中最大优点就是酶的催化专一性强。酶法分析的样品一般不需要进行很复杂的预处理，尤其适合食品这一复杂体系。1.4.5酶与食品生物技术食品生物技术是生物技术的重要分支学科，主要研究基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程在食品工业上的应用。酶工程的主要研究内容是把游离酶固定化，或者把经过培养发酵产生目的酶活力高峰时的整个微生物细胞再固定化，然后直接应用于食品生产过程中物质的转化。酶不仅作为一类重要的研究对象，同时也作为重要的研究工具。课后思考1、酶的特性有哪些？2、国际酶学委员会推荐的分类和命名规则的主要依据是什么？3、酶对食品科学的重要性表现在哪些方面？第2章酶的生产与分离纯化主要内容

2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状

2.2酶的发酵生产

2.3酶的分离纯化

2.4酶分离、纯化的评价

2.5酶的剂型与保存

工业酶制剂的主要来源：动物：猪胰蛋白酶、胃蛋白酶植物：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、麦芽淀粉水解酶微生物：酶的主要来源2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状

目前工业应用的三大主要酶制剂：淀粉酶——烘焙、酿造、淀粉糖化、纺织业蛋白酶——去污剂、奶制品业、皮革业脂肪酶——去污剂、食品、精细化工2.1.2集中垄断，市场全球化规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90%丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）→1978年进入中国诺维信公司，占50%市场（天津）；美国杰能科公司（Genencor）→98年进入中国，与无锡合资，控股80%（无锡），两家公司销售额占全球2/3；（2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收购）；芬兰科特公司和丹麦丹尼斯克公司酶制剂业务合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野2.1.3品种、规模不断扩大目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域;我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主;国际以液体、颗粒为主;国内糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大类占97%;重要产品普鲁兰酶、真菌淀粉酶、系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产;我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。2.1.4应用领域不断扩大美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。2.2酶的发酵生产用于酶发酵生产的细胞需具备的条件：酶产量高容易培养和管理产酶稳定性好利于酶的分离纯化安全可靠

利用微生物产酶的优点：(1)微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2)微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。(3)微生物培养基来源广泛、价格便宜。(4)可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。(5)可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。2.2.1产酶微生物

菌种是发酵生产酶的重要条件。目前投入工业酶发酵生产的菌种约有50～60种，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。2.2.2酶的发酵技术2.2.2.1培养基培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。

（1）碳源碳源是指能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。也是提供能量的能源。碳素是构成细胞成分的主要元素之一，也是各种酶的重要组成元素。所以，碳源是酶发酵生产乃至其他产物的发酵生产必不可少的营养物质。碳源的选择：不同细胞对碳源的利用情况；碳源对酶合成的调节作用；原料的供求和价格最常用的碳源：淀粉及其水解物，如糊精、麦芽糖、葡萄糖等。

（2）氮源氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要组成元素。凡是能够向细胞提供氮元素的营养物质都称为氮源。酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种，有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。一般来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞要求无机氮。异氧型微生物用有机氮，自养型微生物用无机氮。

（3）碳氮比在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。一般蛋白酶

(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)生产采用碳氮比低的培养基比较有利；淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生产的碳氮比略高。

以上是蛋白酶和淀粉酶生产培养基碳氮比的一般规律，但是由于菌种很多而其性质各异。很难说都是符合上述规律的。

（4）无机盐无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。根据细胞对无机元素需要量的大小可分为主要元素和微量元素两大类。

（5）生长因子生长因子是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。

（6）产酶促进剂产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。产酶促进剂大体上分为两种：诱导物和表面活性剂。产酶诱导物一般是酶作用的底物或底物类似物，或是诱导物的前体物质。生产上常采用非离子型表面活性剂，离子型的表面活性剂对微生物有害。

2.2.2.2发酵条件对产酶的影响(1)温度对产酶的影响温度是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素之一。发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，发酵液需要升温。当菌体繁殖旺盛时，情况则相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。微生物生长繁殖和产酶的最适温度随菌种和酶的性质不同而异，二者往往不一致。如红曲霉生长温度35~37℃，而生产糖化酶的最适温度为37～40℃。生长阶段控制在最适生长温度，以利于细胞生长繁殖；产酶阶段，温度控制在产酶最适温度。(2)pH对产酶的影响种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质量。细胞发酵产酶的最适pH通常接近该酶反应的最适pH。一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N低，发酵液倾向于碱性，pH高。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，同时排出代谢产物。这些产物都与pH有直接关系，因此发酵液pH在不断发生变化。这些变化常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。

生产中通常采用控制pH的方法：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的初始pH，保持一定的C/N比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。(3)通风量对产酶的影响通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表。(4)搅拌的影响搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。(5)中间补料的影响中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料，满足微生物的代谢活动和合成发酵产品的需要。中间补料可促使微生物在培养中期的代谢活动受到控制，延长发酵产物的分泌期，推迟菌种的自溶期，维持较高的发酵产物增长幅度，并增加发酵体积，从而使单罐产量大幅度上升。(6)泡沫的影响泡沫的存在阻碍CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。消泡措施：机械消泡化学消泡

消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮。理想的消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难溶于水，还不能影响氧的传递速率和微生物的正常代谢。(7)湿度用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。2.3酶的分离纯化酶的分离纯化目的在于获得一定量的、不含或少含杂质的酶制品或者提纯为结晶，以利于在科学研究或生产中的应用。酶的分离纯化的一般步骤包括选材、细胞破碎、酶的抽提、分离、纯化、结晶，以及酶的纯度鉴定和保存。材料的选择及前处理破细胞抽提浓缩与初步提纯注意点除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心大多数酶在pH<4或pH>10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。酶原料选择的原则：酶含量多、干扰物质少；来源丰富、保持新鲜；容易得到、提取工艺简单；稳定性好、安全性好；有综合利用价值2.3.1酶原料的选择2.3.2.1生物组织的破碎

(1)研磨法/组织捣碎法利用机械力的搅拌、剪切、研碎细胞。常用的有高速组织捣碎机、高压匀浆泵、或直接用研钵研磨等。2.3.2酶的提取(2)超声波法使用超声波破碎仪所产生的超声波（10-15kHz）机械震动后对组织细胞产生的空化作用使细胞破碎。主要问题：

超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶失活。(3)渗透压法细胞在高渗溶液（如蔗糖溶液）中平衡一段时间后，突然转入低渗溶液中，细胞壁由于渗透压的突然变化而溶胀破碎。该方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。(4)冻融法细胞在低温冰冻后再在室温融化，反复冻融就能使细胞壁破裂。所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、络合剂EDTA、还原剂DTT(二硫苏糖醇)等以防破坏目的酶。(5)酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎。将革兰氏阳性菌(如枯草杆菌)与溶菌酶一起温育，就能得到易破碎的原生质体；几丁质酶和3－葡聚糖酶则常用于水解曲霉、面包霉等的细胞壁。(6)化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。常用的化学试剂分为有机溶剂和表面活性剂两大类。①有机溶剂处理常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿。有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。②表面活性剂处理表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。丙酮干粉的制备破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetonepowder)，一般程序是：先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下，加入5~10倍预先冷至约-20℃的丙酮。迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。2.3.2.2酶的提取

酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件。抽提剂由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。

抽提液＝离子强度调节剂十pH缓冲剂＋温度效应剂

(KCl、NaCl、蔗糖)(各种缓冲液)(甘油、二甲基亚砜)

＋蛋白酶抑制剂＋防氧化剂

(PMSF、DIFP)(DTT巯基乙醇)

＋重金属络合剂＋增溶剂

(EDTA、柠檬酸)(TritonX－100)典型的抽提液由以下几部分组成：酶的主要提取方法(1)盐溶液提取大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化钠溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5~0.6mol/L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取：枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取。(2)酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大且稳定性较好，宜用酸溶液提取。例如，从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液进行提取。

(3)碱溶液提取有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌L-天门冬酰胺酶的提取是将含酶菌体悬浮在pH11~12.5的碱溶液中，振荡20min，即达到显著的提取效果。(4)有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等2.3.3酶的纯化

酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。

根据酶和杂蛋白的性质差异，它们的分离方法可分为：（1）根据分子大小而设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。（2）根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。（3）按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。（4）按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法等。（5）按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法、亲和电泳法等。酶的分离纯化方法酶的分离纯化方法等电点沉淀法原理：在低离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带静电荷为零，降低了静电斥力，而疏水能力使分子间相互吸引，形成沉淀。不同的酶和蛋白质等电点不同，可以使pH达到某种酶的等电点，使其沉淀与其他物质分离开来。优点：很多酶的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格较廉，并且某些酸（如磷酸、盐酸和硫酸）的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，也可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。缺点：酸化时易使酶失活，这是由于酶对低pH比较敏感。

盐析法低浓度的中性盐可增加电解质类物质（蛋白质、酶及其复合物）的溶解度，被称为盐溶现象；但当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度反而降低而沉淀出来，称为盐析。原理：盐离子与酶和蛋白质分子争夺水分子，减弱了酶和蛋白质的水合程度，使溶解度降低；盐离子所带电荷部分中和了酶和蛋白质分子上所带电荷，使其静电荷减少，酶和蛋白质也易沉淀。不同酶和蛋白质会在不同的中性盐浓度下析出。在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。有机溶剂沉淀法原理：

加入有机溶剂于酶溶液中产生多种效应，这些效应结合起来，使酶沉淀。其中主要效应是水的活度的降低。当有机溶剂浓度增大时，水对酶分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，因而静电吸力增大。在疏水区域附近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特别强的酶外，对多数酶来说，后者影响较小，所以总的效果是导致酶分子聚集而沉淀。

优点：

溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品级酶。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。缺点：容易使酶变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。离心分离离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

按照离心机的最大转速的不同可以分为常速(低速)、高速和超速三种。常速离心机的最大转速在8000r/min以内，相对离心力(RCF)在1×104g以内，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。高速离心机的最大转速为1×104~2.5×104r/min，相对离心力达到1×104g~1×105g，主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。超速离心机的最大转速达2.5×104~8×104r/min，相对离心力可以高达5×105g。超速离心可以采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。超速离心可用于酶分子的分离纯化。透析与超过滤透析与超过滤技术是利用具有特定大小、均匀孔径的透析膜或超滤膜的筛分机理，在不加压（透析）或加压（超过滤）的条件下把酶提取液通过一层只允许水和小分子物质透过的透析膜或超滤膜，酶等大分子物质被截流，从而达到把小分子物质从酶提取液中除去（透析与超过滤）或同时达到浓缩酶液（超过滤）的目的。凝胶层析凝胶层析有多种名称，又称凝胶排阻层析、分子筛层析法、凝胶过滤法等。根据溶质分子的大小进行分离的方法。根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应不同而对物质进行分离纯化的技术。优点：操作方便，不会使物质变性，层析介质不需再生，可反复使用等。由于凝胶层析剂的容量比较低，所以在生物大分子物质的分离纯化中，一般不作为第一步的分离方法，而往往在最后的处理中被使用。它的应用主要包括脱盐，生物大分子按分子大小分级分离以及分子量测定等。a.小分子由于扩散作用进入凝胶内部被截留；大分子被排阻在颗粒外，在颗粒间迅速通过。b.1.蛋白质混合物上柱，2.洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内大分子被排阻在颗粒外，3.小分子被截留，大分子向下移动，大小分子分开，4.大小分子完全分开，5.大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。（1）凝胶过滤层析的原理①聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺与N，N－甲叉双丙烯酰胺为交联剂共聚而成。商品名是生物胶-P（Bio－GelP），有各种型号，P－后的数字乘以1000表示其分离的最大分子量(即排阻分子量)。(2)凝胶种类(2)凝胶种类②交联葡聚糖凝胶是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从l000~500000的分子。商品名是SephadexG。还有一种通过N，N－甲叉双丙烯酰胺交联的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶（Sephacryl－S)，可适用于水、有机溶剂及高浓度解离试剂存在的系统。另一类Sephadex－LH，适用于脂类化合物的分离。③琼脂糖凝胶琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后所得D－半乳糖和3，6－脱水半乳糖，自动缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定。商品名为Sepharose.这类凝胶孔径都比较大，适于分离较大的物质，如病毒、细胞颗粒和DNA等。离子交换层析离子交换层析是以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物的衍生物作为载体，在某一pH下，这些载体带有正电荷或负电荷，而这时带有相反电荷的酶分子若通过载体，由于静电的吸引力，为载体所吸附。然后用电荷量更多，离子强度更高的缓冲液洗脱，通过离子交换作用使酶分子脱离载体而得以分离。离子交换剂由基质、电荷基团和反离子构成。基质与电荷基团以共价键相连，电荷基团与反离子以离子键结合。根据其反离子与交换离子的不同，可以把离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。当pH低于等电点时，蛋白质带正电荷，能与阳离子交换剂结合；当pH高于等电点时，蛋白质带负电荷，能与阴离子交换剂结合。常见的离子交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-Sep