实验二血红蛋白测定白细胞计数实验

实验二血红蛋白测定白细胞计数实验第一页，共二十三页，2022年，8月28日实验二血红蛋白测定和白细胞计数【目的要求】教学目的：通过实验使学生巩固血液学常见检测项目（主要是血红蛋白、白细胞计数）的检测方法和原理。教学要求：1.掌握血红蛋白、白细胞计数的检测原理；2.熟悉血红蛋白、白细胞计数的检测方法；3.了解血红蛋白、白细胞计数检测的注意事项。第二页，共二十三页，2022年，8月28日实验内容一血红蛋白测定【原理】在血红蛋白转化液中，除硫化血红蛋白外，其余血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与氰离子（CN-）结合，生成稳定的复合物氰化高铁血红蛋白（hemoglobincyanide，HiCN）。棕红色的氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰，可用校准的高精度分光光度计进行直接测定，或用HiCN参考液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。第三页，共二十三页，2022年，8月28日【材料】1．器材：采血针、试管、刻度吸管、微量吸管、吸头、分光光度计。

2．试剂：氰化高铁血红蛋白(HiCN)转化液（文齐液）第四页，共二十三页，2022年，8月28日【实验方法】（1）取血20μl，加入5ml转化液中充分混匀，静置5min。（2）分光光度计，波长540nm处，光径（比色杯内径）1.0厘米，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度（A）。（3）计算：Hb（g／L）＝测定管吸光度×64458／44000×251＝测定管吸光度×367.7。

注：式中：64458是国际公认的血红蛋白分子量，64458mg/L即为1mmol/L血红蛋白的物质浓度，除以1000换算为g/L。

44是1mmol/L血红蛋白在1.00cm光径，540nm条件下的吸光系数。251是稀释倍数。实验内容第五页，共二十三页，2022年，8月28日实验内容分光光度计使用：

1．打开722分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。以722型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：2．将波长旋至测定的波长。第六页，共二十三页，2022年，8月28日第七页，共二十三页，2022年，8月28日第八页，共二十三页，2022年，8月28日3．将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。

第九页，共二十三页，2022年，8月28日4．将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0，关上比色池盖子，调节T为100.0。

第十页，共二十三页，2022年，8月28日第十一页，共二十三页，2022年，8月28日第十二页，共二十三页，2022年，8月28日5．将开关置于A，用消光调零调节A为0.0。6．将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）。第十三页，共二十三页，2022年，8月28日实验内容二白细胞测定【原理】用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。第十四页，共二十三页，2022年，8月28日【材料】1．器材（1）采血针、微量吸管、吸头、试管、5ml吸管（2）普通光学显微镜（3）计数板、盖玻片（专用）改良Neubauer计数板，有两个计数池。每个计数池分为九个大方格。每个大方格的边长为1mm，高度为0.1mm，面积为1mm2,容积为0.1mm3。四角的每个大方格被分为16个中方格；中央大方格被分为25个中方格，而每个中方格又被分为16个小方格。第十五页，共二十三页，2022年，8月28日Whitecellcount(WBC)coverslip

Theareaofcountingis1mm2andthedepthofitis0.1mm,sothevolumeis0.1ul.(1mm3=1uL)CountingChamber’sstructure0.1mmdeep第十六页，共二十三页，2022年，8月28日第十七页，共二十三页，2022年，8月28日Whitecellcount(WBC)CountingareaCountingruler1mm1mm第十八页，共二十三页，2022年，8月28日2．试剂白细胞稀释液：冰乙酸2.0ml10g/L亚甲蓝数滴蒸馏水加至100ml第十九页，共二十三页，2022年，8月28日【实验方法】1、加白细胞稀释液0.38ml于一小试管中。2、用微量吸管吸取20ul血液。擦去微量吸管外余血，将其插入稀释液底部，轻轻将血放出，并吸取上清液洗涤微量吸管3次（注意每次不能冲浑稀释液），混匀。3、用微量吸管或玻璃棒取混匀的细胞悬液1滴，充入计数池与盖片的缝隙中，静置2-3min，使白细胞下沉。4、低倍镜计数四角4个大方格内白细胞总数，数细胞规则“数上不数下，数左不数右”。第二十页，共二十三页，2022年，8月28日5、计算白细胞/L=N/4×10×20×106/L=N×0.05×109/L式中：N为4个大方格内白细胞总数

÷4为1大方格（即0.1ul）内白细胞记数

×101个大方格的容积为0.1ul，换算成1ul×20血液的稀释倍数

×106

将ul换算成L第二十一页，共二十三页，2022年，8月28日注意事项：

1计数池内细胞分布每大方格数不能超过四大格均值的+10%，白细胞数小于3×109/L时要扩大计数区域或重新加倍取血计数；白细胞大于15×109/L时，要增加稀释倍数，重新计数。

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