PCR技术及重组DNA技术

PCR技术及

重组DNA技术PCR技术一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点PCR反应标准体系模板DNA0.1～2ug4种dNTP混合物各200umol/L特异性引物各10～100pmolDNA聚合酶2.5uPCR缓冲液：Tris-Hcl10mmoL/LKcl50mmol/LMg2+1.5mmol/L乙酰BSA0.1mg/mlPCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417实验步骤（1）在250ulPCR管内配置25ul反应体系：

CK(ul)1#(ul)模板02引物10.50.5引物20.50.510×PCRBuffer2.52.5Taq酶0.30.3dNTPs2.02.0ddH2O19.217.2Total2525（2）PCR反应程序(1)95℃变性5min，(2)94℃变性30S，(3)52℃退火30s，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重复(2)-(4)30次PCR结果：1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）PCR产物的电泳鉴定PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，1～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA（1）模板单、双链DNA均可，多种来源。质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般人基因组100ngDNA模板（100L）。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应的影响因素

1)反应体系Lambda

DNA，模板量分别为100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

（2）引物引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断。引物是PCR反应中最关键的因素，因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。

引物设计的原则：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列的查找可在相关的网址，如/pubmed查找各种目的序列。同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构（发夹结构）。（5）两引物间避免有互补序列（二聚体）。（6）3’端一定要与模板严格配对，5’端可引入突变，加酶切位点等。引物设计引物设计常用软件主要有：PrimerPremier5.0

Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer

1.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法在对话框中输入待扩增序列点击左上角的“Primer”按钮2.设置相关参数3.得到的引物结果Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构Dimer:同一种引物是否会形成二聚体Falseprimiring:引物在待扩增序列中其他位置是否有配对CrossDimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和反向引物的互换正向和反向引物的评价正向和反向引物的信息每点击左边红色的按钮，就出现相应的内容对正向和反向引物进行编辑可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基引物的信息改动后引物的信息重新回到双引物的界面“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.输出引物序列引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。普通PCR：OPC纯（>95%）较长引物（大于50个碱基）：PAGE纯（>95%）经过修饰或标记的引物：HPLC纯（>99%,但价格昂贵）引物浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。（3）耐热DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半寿期为40min最适温度（72℃）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸酶活性（受多种因素影响）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆转录酶活性，非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3‘端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3’端突出一个单A核苷酸尾PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于>2kb的片断扩增。VentDNA聚合酶：又称TliDNA聚合酶，该酶耐高温且具有3‘-5’外切酶活性的校对功能，其保真性较TaqDNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（>12kb）的功能较强。2）其他的耐热聚合酶（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。

Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数变性使双链DNA解链为单链

94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。

增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加思考题：

1.一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？2.影响PCR反应成败的因素有那些？重组DNA技术

重组DNA技术的概念重组DNA技术的基本条件工具酶目的基因运载体用于基因转移的受体菌或细胞重组DNA技术的基本过程举例说明主要内容：是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆。DNA克隆一、重组DNA技术概念二、重组DNA技术的基本条件（一）工具酶（二）目的基因（三）运载体（四）用于基因转移的受体菌或细胞（一）重要的工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定义：Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用特点——

回文结构

大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个～8个核苷酸组成的特定序列。Ⅱ型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（如图）。“回文”意为顺读和倒读都一样的。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口2.DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”)

（1）T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导。（2）大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接。3.DNA聚合酶（1）TaqDNA聚合酶:耐热（75-80℃），分子量65kD,也具5’和3’外切酶活性。（2）反转录酶(RDDP):多功能酶，无3’和5’DNA外切酶活性，具有3’和5’RNA外切酶活性。进行DNA重组的目的主要有两方面：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。（二）目的基因（二）目的基因1.表达载体:为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。2.克隆载体:为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。（三）运载体（三）运载体运载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有与特定受体细胞相适应的复制点或整合位点具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记（四）用于基因转移的受体菌或细胞常用受体类型：

大肠杆菌：背景清楚，生长迅速，培养简单等，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。

酵母菌：具有真核生物特性，背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定，可用于基因的克隆，表达，基因文库的构建等，是DNA重组实验和基因工程的重要的真核性受体菌。

哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）：与人的亲缘关系近，分子表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统；细胞培养条件苛刻，生长缓慢；适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究，是DNA重组实验和基因工程的主要的哺乳动物受体。三、重组DNA技术的基本过程基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交重组DNA技术操作过程可形象归纳为：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线

以质粒为载体的DNA克隆过程目的基因的获取和体外重组化学合成法：较短的基因（60-80bp）要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库cDNA文库聚合酶链反应一.目的基因的获取:PCR技术的基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪95oC5min94℃55℃72℃PCR技术获取目的基因:外源基因与载体的连接:体外重组方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接粘性末端连接DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶16ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶16ºC重组体平端连接

限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶16ºC重组体载体自连目的基因自连在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。同聚物加尾连接DNA连接酶同聚物尾巴同聚物加尾法连接重组DNA分子由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头(linker)连接利用人工合成的接头连接重组DNA分子5.T-A克隆T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。(一)、重组DNA分子的导入重组DNA分子的导入和筛选与鉴定常用的导入方法:

（一）转化（二）转染一）转化方法1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌二）转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔:操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。

脂质体转染:脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达(一）根据重组载体的遗传表型进行筛选1．根据载体的抗药性标记筛选2．根据载体的抗药性标记插入失活选择3．根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选4．根据插入的外源基因性状进行筛选（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法(六)DNA序列检测(二)、重组体的筛选与鉴定AmprTetrBamHⅠ位点BamHⅠ酶切BamHⅠ酶切DNA连接酶目的DNA重组质粒大肠杆菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板四、举例说明(一)引物的设计及合成根据本实验室已经完成全基因序列测定的豹源FCV的ORF2序列设计引物，选择的酶切位点为EocRI/XhoI，扩增目的片段长度为1734bp。上游引物序列：CCGGAATTCCGGATGTGCTCAACCTGCGCTAA；下游引物序列：CCGCTCGAGGTTAATGACATAGCCCAATTTTAGTGTG；引物送往生工生物工程上海股份有限公司合成。（二）目的基因片段的扩增以本实验室保存的含有豹源FCVORF2的质粒为模版，用高保真ExTaqDNA聚合酶进行目的基因的扩增。扩增体系为：模板2μL、dNTPs2μL，PCR缓冲液2.5μL，上、下游引物各0.5μL，ExTaqDN