WB的失败图分析

WB问题条带分析

报告人：杨羚1、目的条带啥也没有原因：只重复做没有思考。这次目的条带和内参的二抗种属是不同的。网上查阅经验：一点没有，甚至连内参都没有，可能抗体加错了，转膜问题甚至膜放反；

条带细微接近没有，上样量少，一抗浓度低，显色液失效...........解决办法：实验前检查抗体种属是否加错，确认转膜没有问题。20150825_重复做CST1只有点内参20150826_CST1重做2、高背景20150814_JNk高效价第一次.bmp原因：封闭不够好，洗膜不充充分，抗体浓度特别是二抗过高。网上查阅经验：奶粉封闭时间够，注意操作规范，不偷工减料洗膜实际解决方法：奶粉封闭时间延长了半个小时，对于这种剪小后的片，用小洗涤盒洗，总之保证其洗膜充分20150816_JNK高效价第二次.bmp3、出现许多黑点和斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合。网上查阅经验：不要封闭时才去匆忙配奶粉，要确保奶粉完全溶解,否则不溶颗粒附着膜上。溶解后静止，轻吸上层牛奶封闭，封闭结束，三次洗膜彻底

201507内参略成功.bmp20150829sirt3失败品4、条带拖尾可能原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长;个人猜测，跑胶的问题解决办法：调整蛋白量，同时一抗浓度缩小和孵育时间缩短

201508-HSF-LXF..jpg5、出现非均一性背景原因：膜可能干过！解决办法：确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。

Gapdh.jpg6、条带中出现规则白圈原因：转膜出现气泡！网络经验：放膜时候，使膜U型放，两边下压；盖海绵前，确定气泡除尽，盖后放置动作要小幅轻微，防止产生不必要的气泡。

7、最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均解决办法：尽量不使用两边的两孔

BNP+Gapdh.jpg8、其他电泳过程出现的问题现象（1）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。（2）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。（6）在分离胶中跑不动：Tris-ClPH值不对，或者忘记加SDS。8、配胶问题导致的失败——条带变形

原因：胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整解决办法：配胶的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时间避免大幅度动作触碰。

9、配胶问题导致的失败——条带哑铃状原因：配胶问题，可能是插或拔梳子引起的凹凸不平整；还有可能，样品含较多杂质杂质沉积空中间.......10、其他（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。(4).