实时定量PCR技术

实时定量PCR技术

韩东洺2015-07-08目录实时定量PCR介绍荧光PCR实验设计QuantitativeReal-timePCR技术的应用PCR

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。实时定量PCR实时定量PCR(Quantitative

real-timePCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新技术。是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。☞与传统PCR一样用同样的基本成分：

双链DNA，引物，dNTPs，PCRbuffer，Taq酶等。☞与传统PCR一样，反应在温度模块里循环进行：

>双链DNA模板变性>引物与模板碱基互补-退火>引物延伸→新的扩增片段基本原理

实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。

在PCR反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量。主要类型根据Quantitativereal-timePCR的化学发光原理可以分为2大类：1、探针类

包括TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；2、非探针类其中包括如SYBRGreenI或者特殊设计的引物(如LUXPrimers)通过荧光染料来指示产物的增加。Taqman探针法Taqman探针法是最早用于定量的方法。特异性的荧光探针：该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)。该探针在PCR过程中不能被延伸。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。因此该技术可对模板进行准确定量。Taqman探针法SYBRGreen法SYBRGreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreen法是非特异性检测扩增序列的代表。SYBRGreen法局限性：可与所有双链DNA序列结合，从而降低了特异性。为避免假阳性信号，应使用熔解曲线（meltingcurve）或凝胶分析来检查非特异性产物的构成。熔解曲线扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。随着反应中双链DNA的变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰可将特异产物与其他产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同温度熔解。熔解曲线如果熔解曲线做出来的只有单峰，而且出峰的位置所对应的退火温度与所需退火温度相同，那么该荧光数据有效。只有一个的峰=没有多余的产物↑荧光温度→可能是引物二聚体SYBRGreen法和Taqman探针法比较QuantitativeReal-timePCR与常规PCR的比较荧光PCR实验设计

实验操作注意事项预防RNA酶的污染：全程佩戴一次性手套、口罩，少说话。使用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理并灭菌的器材。Mix配制：试剂不要反复冻融，若经常使用，最好放在4度。每管或每孔都要换新枪头！所有成分加完后，离心去除气泡。Real-timePCR引物设计原则Taqman探针设计原则G反应体系优化误差控制配置预混体系设置生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔）阴性对照实时荧光定量检测系统

——实时荧光定量PCR仪普通PCR仪7500型荧光定量仪工作流程无论是哪个型号，所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分：在扩增的过程中，荧光信号随着PCR产物的增加而增强。每个循环结束后，定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号的增加。最后，定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析。基因表达数据分析——常见参数☞基线(baseline)：一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线。☞荧光阈值(threshold)：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10´SDcycle3-15。☞

Ct值(Ctvalue)：C代表Cycle，t代表threshold，因此也称阈值循环(thresholdcycle)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。所以Ct值是一个没有单位的参数。影响Ct值的关键因素

模板浓度：模板浓度是决定Ct值的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct值在15-35之间。

反应液成分的影响：任何分子的荧光发射都受环境因素影响——比如溶液的pH值和盐浓度。

PCR反应的效率：PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。

PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。评估实时定量PCR反应的效果数据分析方法标准曲线法

2－△△CT法要使△△CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物△CT如何变化。y=-3.3168x+24.989R2=0.992QuantitativeReal-timePCR技术的应用

QuantitativeReal-timePCR技术广泛应用于基础科学研究、临床疾病诊断、疾病研究及药物开发等领域。在临床医学上应用很多，发挥重要的作用，包括在病毒检测诊断方面的应用、在遗传性疾病诊断方面的应用、在肿瘤诊断方面的应用等。在分子生物学方面的应用主要是：1、基因表达的研究2、基因突变及多态性研究3、转基因研究（DNA或RNA的定量检测）1、基因表达的研究

在基因表达的研究中，常用的方法有Northern印迹，RT-PCR定量法等，而QuantitativeReal-timePCR比Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确的多。QuantitativeReal-timePCR能检测各种组织细胞中基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控mRNA表达模式、检测组织中少量存在的基因、跟踪细胞群体中克隆、定量分析基因在不同组织中的转录水平等。

2、基因突变及多态性研究

扩增DNA的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主细胞内的生长准备，即可在媒介中的生物分子纯化过程中直接测得，因此QuantitativeReal-timePCR可用于检测特异突变基因。利用QuantitativeReal-timePCR和有关的间接测序方法，可对已知DNA序列进行基因突变及多态性的分析。如对已知DNA序列进行位置突变基因及序列多态性的定位，扩增DNA限制性位点检测遗传变异等。3、转基因研究

有研究者用QuantitativeReal-timePCR检验转基因水稻的外源基因拷贝数，定量