第五章分子生物学研究法(上)2

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术

第五章

扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。RNA基本操作技术真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。5.3RNA基本操作技术5.3.1总RNA的提取5.3.2mRNA的纯化5.3.3cDNA的合成5.3.4cDNA文库的构建5.3.5基因文库的筛选5.3.1总RNA的提取细胞中的总RNA包括：mRNA1%~5%rRNA80%~85%tRNAsRNA15%~20%Trizol总RNA提取试剂

TIANGENrRNA电泳后的三条特征性条带28S、18S、5S(特别是28S和18S特征性条带)是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。RNA的抽提方法1.实验室常用方法：异硫氰酸胍－苯酚抽提法Trizol试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，释放细胞质及细胞核中的RNA，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。

Trizol提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加入trizol试剂，再加入氯仿抽提，分离水相，异丙醇沉淀。RNAExtractionbyTRIzol使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸mRNAExtractionfromCellCulturemRNAExtractionfromTissue2.硅胶膜纯化柱法将含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱RNA。RNA的浓度和纯度的判断：可通过测定其OD260和OD280OD260＝1时，相当于浓度为40μg/mL，当OD260/OD280＝1.8～2.0时，说明RNA纯度较好。5.32.mRNA的纯化寡聚（dT）－纤维素柱色谱法：利用mRNA3’端含有PolyA+的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此柱可得到较高纯度的mRNA.PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。图5-14PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图。每个OligotexKit包括用于结合polyA+mRNA的Oligotex树脂，和用于洗涤、洗脱结合的mRNA的离心柱。OligotexmRNAKits可从总RNA中纯化mRNA，回收polyA+体外转录子。OligotexDirectmRNAKits可从细胞和组织中纯化mRNA。mRNAExtractionfromTotalRNA5.3.3cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。图5-15cDNA合成过程示意图。第一链cDNA的合成：以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，需引物（常用oligodT）。第二链cDNA的合成：以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。图5-16cDNA合成中的分子修饰。cDNA的合成5.3.4cDNA文库的构建cDNA文库：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。构建cDNA文库的基本程序：①mRNA的提取和纯化。②合成cDNA第一链。③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：基因文库的建立基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组文库与cDNA文库的差别基因组文库中包含了所有基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大cDNA文库代表了mRNA的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能基因组文库由于含有不表达序列，比cDNA文库大mRNA在不同组织之间存在丰度差异，因此cDNA文库在构建时对于mRNA含量较少的就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题5.3.5基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程。核酸杂交法PCR筛选法前提：已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。步骤：（1）将文库保存在多孔培养板上

（2）用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性孔（3）把阳性孔中的克隆稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。（4）重复以上程序，直至鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。免疫筛选法原理：抗原抗体特异性结合适用于对表达文库的筛选文库铺于E.coli形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜保存原板加入一抗筛选膜上的噬菌斑印记吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗E加底物显色从保存板中挑出阳性噬菌斑5.4SNP的理论与应用SNP的定义定义：单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。

是第三代遗传标记。5.4.1SNP概述单倍型：是指位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。SNP分类：cSNP同义cSNP非同义cSNPpSNPrSNP5.4.2SNP的检测技术传统的SNP检测方法使用的技术主要有：限制性酶切片段长度多态性（RFLP）；PCR－单链构象多态性（PCR－SSCP）；毛细管电泳；变性高效液相色谱（DHPLC）等。目前获得新的SNP最常见的方法是：通过DNA测序法基因分型（genotyping）：是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究。主要包括：基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术焦磷酸测序法等。基因芯片技术是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。通过激光扫描，可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被检序列的碱基类别。优点：高通量一次可对多个SNP进行规模性筛选被检起始材料少操作步骤简单缺点：芯片设计成本高若样品复杂，有些SNP不能被检出Taqman技术在PCR反应系统中加入2种不同的荧光标记探针，分别与两个等位基因完全配对。分子信标技术分子信标：是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5～8个碱基组成，5’带有荧光发生基团，3’带有荧光猝灭基团。自由状态时，发生荧光共振能量转移，无荧光；当分子信标与靶分子结合时可检测到荧光。Taqman和分子信标法优点：可同时对多个SNP进行分析，操作简单，可自动化；缺点：不能达到高通量分析，荧光探针费用高。焦磷酸测序法

(Pyrosequencing)四种酶催化的酶级联反应:DNA聚合酶、硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase)。反应底物：APS和荧光素（luciferin）原理：DNA聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引发一种化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。基本步骤1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。2.四种dNTP（dATPαS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入