细胞生物学设计型

实验项目：动物细胞融合细胞生物学设计型实验演讲人：李2014年12月2日目录实验目的实验原理实验步骤实验预期结果融合率的计算实验试剂及材料注意事项一、实验目的了解动物细胞的融合熟悉PEG诱导细胞的方法掌握动物细胞融合的基本原理及方法培养学生自主设计实验，发现问题和解决问题的能力二、实验原理一、动物细胞融合1、概念：细胞融合：又称细胞杂交，由两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为细胞自发融合和诱导细胞融合。诱导细胞融合：指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象自发细胞融合：指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融合现象。人工合成形成的融合细胞有两类同核体异核体由同一亲本细胞融合而来有不同亲本细胞融合而来2、动物细胞融合的基本原理与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性3、诱导方式物理法：电激、振动、离心化学法：聚乙二醇（PEG）生物法:灭活病毒（如：仙台病毒）4、动物细胞融合的意义打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；广泛应用于多个学科领域；重要途径：制备单克隆抗体。三、实验步骤（一）、50%PEG液的制备：取一定量的得PEG（MV=4000）放入刻度离心管内，在酒精灯上加热，使其融化，冷却至50℃时，加入等体积的Hanks液混匀，置之37℃水浴箱中保温待用。（二）、融合方法：取肝素抗凝的弃血清鸡血0.1ml（本实验是进行同种细胞融合）。将悬液移入离心管中，以800r/min离心7~8min，弃上清液，加入8~10mlHanks液，再次悬浮细胞，离心洗涤二次，弃去上清液后将离心管倒置在滤纸上，尽量流尽剩余液体（这一步很重要，因为残余液体会改变PEG的浓度）。用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制备好的50%PEG4ml，在37℃水浴中，于90s内逐滴加入离心管中，边加边震荡离心管，使之与细胞混匀，然后加入8~10Hanks液，轻轻吸打混匀，在37℃水浴中静置5min以稀释PEG。离心弃去上清液后，加2~3mlHanks液，在37℃水浴中温育30min。实验操作流程（一）50%PEG液的制备取一定量PEG放入刻度离心管内在酒精灯上加热使其融化待降至50℃时加入等体积预热的等体积Hanks液混匀置于37℃水浴箱中保温待用（二）、融合方法取肝素抗凝鸡血0.1ml制细胞悬液离心管中800r/min离心7~8min倾去上清液加入8~10mlHanks将悬液移入倾去上清液，将离心管倒置于滤纸上离心管用手轻弹吸取50%PEG0.4ml再次悬浮细胞离心洗涤二次在37℃水浴中加入7~8mlHanks于90s内逐滴入离心管在水浴中静置5min稀释PEG弃去上清液在37℃水浴中温育3min在5min10min15min20min30min取悬液制片用0.2%甲基蓝染色观察加2~3mlHanks四、预期结果融合过程观察：分别于温育5min10min15min20min30min取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把融合过程大致分为五个阶段。两个细胞的膜相互接触，粘连。相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。两细胞之间的细胞质相遇，形成细胞质通道。通道扩大，两细胞连成一体。细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。五、融合率的计算融合率：是指在显微镜视野内，已发生融合的细胞，其细胞核的总数与视野内所有细胞（包括已融合和未融合细胞）的细胞核总数之比。

对孵育30min时制备的临时装片计算融合率，通常以百分数表示，进行多个视野测定值得平均统计更加准确。

融合率=（融合的细胞核数/总细胞核数）*100%六、实验试剂及材料1、材料：鸡红细胞2、试剂：聚乙二醇（PEG，MV=4000）、Hanks液、0.2%次甲基蓝染液。3、仪器设备：显微镜、水浴箱、离心机、离心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管、吸管，天平、滤纸。实验试剂表名称规格用量说明聚乙二醇0.5ml使细胞膜重排Hanks液10ml洗涤营养细胞0.2%甲基蓝染色液适量染色实验仪器、设备、器具表名称规格、型号数量说明显微镜1观察细胞融合水浴箱1加热有利细胞融合离心机1使细胞分离离心管2装离心液载玻片5制作装片盖玻片5制作装片吸管4吸收细胞液试管3装液酒精灯1加热PEG天平1配平滤纸1吸水七、注意事项制备的50%PEG一定要保存于37℃水浴中，