矿化胶原涂层作为生物涂层材料的可行性,医学工程论文

矿化胶原涂层作为生物涂层材料的可行性,医学工程论文20世纪60年代，自从来自瑞典的生理学家Brǎnemark教授发现钛金属与兔子胚骨的牢固结合以来，钛金属就因其良好的力学性能、生物相容性及耐腐蚀性能等优点，被广泛用于骨科及口腔外科[1].但是，钛金属本身是一种生物惰性材料，需要对其进行外表改性，使其变成活性外表才能进一步促进钛金属作为种植体的应用前景。当前，对钛金属种植体的外表改性主要有两种思路：外表物理形貌改性和生物化学组成改性。物理形貌改性即改变其外表形貌、微观构造、粗糙度等物理性质。生物化学组成改性，即改变钛金属体的外表成分，比方在钛种植体外表引入一些微量元素、生物活性涂层〔羟基磷灰石、氧化钛等〕和胶原蛋白等生物活性因子，提高种植体外表的生物活性[2-3].研究表示清楚，骨组织中的无机成分主要是羟基磷灰石，因而具有良好的生物相容性[4-8].而胶原蛋白则是一种结晶纤维蛋白，是骨组织中最主要的有机成分。因而，将羟基磷灰石〔Hydroxyapatite,HA〕、胶原蛋白直接制备于钛种植体外表构成复合涂层，是提高钛种植体临床成功率的重要手段。本研究采用电化学沉积法[9-10]在钛基板外表制备仿细胞外基质涂层HA/胶原蛋白复合涂层，研究矿化胶原涂层作为生物涂层材料的可行性。1材料与方式方法1.1实验材料选用2.0cm1.0cm0.1cm的纯钛片30片〔温州钛京生物科技有限公司，中国〕,用金相砂纸从1500目到4000目将其外表磨平，再用无水乙醇和去离子水超声条件下清洗干净，去除其外表的油污。分为实验组〔矿化胶原涂层〕、对照组〔纯钛片〕两组备用。1.2电化学沉积法制备矿化胶原涂层1.2.1电解液的配置将Ⅰ型胶原牛跟腱〔河北考力森生物科技有限公司〕酶解在0.005mol/L的醋酸溶液〔国药集团化学试剂有限公司〕中，得到0.5mg/mL的胶原溶液；体积比以1∶1∶8配置80mmol/LCa〔NO3〕2、160mmol/LNH4H2PO4和胶原溶液电解液。1.2.2电化学沉积经过利用Chi604c电化学工作站〔上海辰华仪器有限公司〕作为沉积设备，实验组采用双电极电解沉积法，以钛基板作工作电极，纯铂片作为阳极，两电极间距固定值为2cm.整个电沉积经过中沉积温度利用恒温水浴37℃反响容器进行控制。电压设定为2.6V,沉积时间为30min.采用控制电位电解库仑法进行电化学沉积，得到矿化胶原涂层。沉积结束后，能够观察到矿化胶原涂层会逐步附着在钛金属基板的外表上呈现凝胶形式，先用去离子水轻轻地冲洗涂层，洗去粘附其上的钙离子等溶液中的离子，再将附有矿化胶原涂层的钛金属基板在空气中水平地放置，使其自然枯燥，最终制备获得具有矿化胶原涂层外表附着的钛金属基板。1.3生物学性能评价1.3.1矿化胶原涂层在模拟体液〔simulatedbodyfluid,SBF〕泡在含有7mL模拟体液的聚乙烯塑料离心管中。然后将试管置于37℃的恒温箱中，分别震荡浸泡3、7d,取出并用去离子水冲洗，自然风干，华而不实隔天更换一次SBF溶液至7mL.样品置于37℃的恒温箱中保存，用于扫描电镜〔SEM〕〔日立公司，日本〕观察其外表矿化行为。1.3.2MTS法检测细胞粘附及增殖用来做检测的细胞采用从ATCC公司购买的MC3T3-e1细胞，在37℃、5%CO2浓度条件下，使用含10%胎牛血清和1%抗生素〔青霉素和链霉素〕的DMEM培养基中于细胞培养箱中培养，每隔一天更换一次培养液，待细胞长满培养瓶时，进行细胞传代待用。采用MTS法〔Promega,Madison,WI,G358B〕测定活性细胞数量，实验将MC3T3-e1培养于矿化胶原组及空白钛基板外表，24、72h后分析细胞粘附、增殖情况。详细步骤如下：细胞以2.5104个/cm2植入24孔板，在每个孔中参加0.5mL培养液。对于培养24h的样品，先将培养液吸除，再用PBS将样品清洗两遍，然后参加0.5mL新的培养基和50LMTS液，将培养板转移放置在37℃的培养箱中培养4h;汲取120L的培养液至96孔板中，在Model680酶标仪〔Bio-Rad,美国〕上测定吸光密度值〔OD值〕〔490nm波长处〕.对于培养72h的试样，则直接在原培养液中加50LMTS液，将培养板转移放置在37℃的培养箱培养4h,然后汲取120L至96孔板测定其OD值。1.3.3Western-Blotting法检测细胞分化在放置1cm1cm大小纯Ti组、矿化胶原涂层组的24孔板中以密度为2.5104个/cm2植入成骨前体细胞〔MC3T3-e1〕,每组试样均为3块。分别培养1周、2周后，提取蛋白并变性，采用SDS-聚丙烯酸胺凝胶法跑电泳及转膜，将偏二氟乙烯〔polyvinylidene-fluoride,PVDF〕膜置于5%的脱脂奶粉中室温封闭2h,一抗〔分别为甘油醛-3-脱氢酶GAPDH、碱性磷酸酶ALP、胶原蛋白COL-1〕4℃过夜作用，TBST摇床洗涤4~5次，参加适量二抗室温孵育1h并洗涤数次，显色液显色作用后，于曝光仪〔Bio-Rad,美国〕内密闭曝光并分析数据。2结果2.1矿化胶原涂层在SBF中的行为图1显示，通过在SBF中生物活性材料外表的矿化经过观察能够初步估计其在实际植入体内经过中构成羟基磷灰石骨性结合的能力。图1显示，SBF溶液中浸泡3d后，胶原涂层本来致密的构造出现了矿化胶原束，涂层形貌上出现了一些微孔，这是由于有一部分涂层溶解导致；而经过7d的模拟体液浸泡之后，能够看到矿化胶原涂层发生了较为明显的矿化。2.2矿化胶原涂层对细胞粘附、增殖的影响细胞培养1d并用PBS去除未贴壁细胞后显示：实验组OD值大于纯Ti组，两者有显着性差异，这证明了矿化胶原涂层能促进植入初期细胞的附着；对72h细胞增殖培养后比拟表示清楚：矿化胶原组OD值大于纯Ti组，两者有显着性差异，讲明了矿化胶原涂层能促进细胞的增殖〔图2〕.2.3矿化胶原涂层对细胞分化的影响本实验通过Western-Blotting法比拟1周及2周各矿化胶原涂层外表的成骨前体细胞的ALP及COL-1表示出。华而不实培养1周后结果显示：矿化胶原涂层ALP、COL-1表示出程度均高于纯Ti涂层组，且结果具有显着性差异，表示清楚矿化胶原涂层能加速成骨前体细胞的分化进程；对2周后细胞分化相关因子检测表示清楚：矿化胶原涂层及纯Ti组ALP表示出水平基本无差异，而涂层组COL-1表示出水平均显着高于纯Ti组，但却略低于一周组，涂层组已进入分化晚期，明显优于纯Ti组〔图3〕.3讨论随着临床应用的日益广泛，怎样通过对钛金属外表进行适宜的改性，有利于细胞组织，尤其是成骨样细胞在其外表的附着生长，进而促进骨整合，是当下提高钛种植体临床应用效率的研究热门。由于羟基磷灰石的构造成分与天然骨组织特别类似，被包埋在含有钙盐的基质中，使骨组织表现出良好的韧性，所以将其植入体内后会与周围的生物环境发生融合作用，且其外表会重新沉积一层类骨磷灰石。新生骨既能够在羟基磷灰石外表生长，可以以在周围骨组织外表生长，构成双向生长。这种双向生长能够促进植入体与骨组织间构成直接的化学键合，有利于植入体的骨结合。Wang等[12]研究表示清楚TiO2生物活性层能有效促进HA/胶原复合涂层的制备。同时，在钛种植体外表制备HA/胶原复合涂层，能够显着提高其生物活性，赋予其丰富的生物信号，加强其诱导和促进骨组织生长的功能。研究表示清楚，在体内环境中由于成骨细胞本身就能够分泌胶原蛋白，并与其他细胞协同作用，使胶原蛋白自组装构成有序的骨组织雏形。随后，羟基磷灰石等无机盐沉积上去，也就是我们所讲的矿化经过，最终构成新的骨组织。由于骨组织的细胞外基质主要由胶原蛋白等有机成分和羟基磷灰石等无机成分构成，在钛种植体外表构建出羟基磷灰石/胶原蛋白〔矿化〕复合涂层，肯定能促进骨细胞的吸附、生长以及增殖，而且还能够增加其承载生物活性因子和药物的能力[13-16].假如在钛金属植入体外表直接引入羟基磷灰石矿化的胶原蛋白，就能够显着促进成骨细胞的生物活性表示出，进而大大的提高其骨结合的效率与效果。本文以能够促进骨修复及种植体骨整合为最终目的，从医用钛金属、生物活性高分子胶原蛋白、生物活性陶瓷羟基磷灰石出发，采用电化学沉积的方式方法在具有多孔氧化层的钛基板上沉积了胶原与羟基磷灰石的准三维矿化胶原涂层，制备了一种同时具备三类生物材料优势的生物活性涂层。这种多孔的矿化胶原涂层不仅在成分上有利于成骨细胞的生物活性表示出，而且给细胞之间提供了互相连接的空间。这对细胞之间互相协同作用的通道表示出非常重要，也是该矿化胶原涂层表现出相对于纯钛金属显着更好的生物活性的一个重要原因。通过体外模拟环境验证基于该矿化胶原涂层的钛种植体将大大加速植入体外表矿化进程；体外细胞实验也证实了矿化胶原涂层能显着提高钛植入体的生物活性，成骨前体细胞粘附效率得到了有效的提高并促进了细胞增殖；同时，通过比拟不同矿化涂层及纯Ti对于成骨前体细胞分化的促进作用，表示清楚矿化的胶原涂层可加速细胞分化进程。在模拟液SBF中，矿化胶原涂层能稳定存在并发生进一步矿化，此矿化层同羟基磷灰石晶相类似，故将促进种植体外表骨整合水平，改善植入体生物活性。体外细胞实验表示清楚矿化胶原涂层能加速成骨前体细胞的附着并促进其增殖；同时，矿化胶原涂均能显着加速成骨前体细胞的分化，其更快地表示出成骨分化初期细胞因子ALP及晚期指标COL-1蛋白。故揣测涂层组富含胶原类蛋白，可被细胞外基质所辨别，加速细胞的粘附及增殖，对于涂层组更快地进入细胞初期分化进程，原因可能在于其更快地到达了细胞