第20 高效液相色谱法

第二十章高效液相色谱法HPLC第一节概述highperformanceliquidchromatography一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、高效液相色谱仪流程图四、特点以气相色谱理论为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法（一）HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相；分析周期长；柱效低（H↑，n↓）；无法在线检测，灵敏度差2．HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相；分析时间大大缩短；柱效高（H↓，n↑）；可以在线检测，灵敏度高

表20-1HPLC法与经典LC法性能对比

经典LC

HPLC固定相一般规格特殊规格固定相粒度(μm)75～5003～10粒度分布(RSD)20～30％＜5％柱长（cm）10～1003～25（分析型）柱内径（cm）2～50.3～0.46柱入口压强(MPa)0.001～0.12～40柱效（理论塔片数/m）10～1003×104～8×104样品用量(g)1～1010-6～10-4分析所需时间(h)1～200.05～0.5装置非仪器化仪器化2/5/2023二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、热稳定性差、离子型等样品不可检测占有机物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置续前四、HPLC的特点和应用

“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）第二节基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论——平衡理论动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三、HPLC法中分离条件的选择基础一、塔板理论二、速率理论（与GC对比）

1.2）涡流扩散项A及其影响2.讨论：

1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next图示back续前3）传质阻抗项及其影响

固定相传质阻抗CS：因固定液膜厚度df极小，固定相传质阻抗CS可以忽略流动相传质阻抗Cm：静态流动相传质阻抗CSm：在固定相微孔内的滞留的流动相产生的传质阻抗传质阻抗项与流动相的粘度及柱温有关图示降低板高的途径有：（1）小粒度（dp小）、均匀的球形化学键合相（A、C小），匀浆法装柱（2）低粘度流动相（C小），如甲醇（乙醇与甲醇的理化性质相似却无毒,但25℃时粘度是甲醇的2倍）（3）流速不宜过快（1ml/min），（Cu小）（4）增加柱长L，可增加n，但同时也增加tR,

增加分析时间，一般不可取的。

（5）柱温适当，如室温25℃左右第三节各类高效液相色谱法

HPLC法分类：按固定相聚集状态：液-液色谱法（LLC）液-固色谱法（LSC）按分离机理：分配色谱法（partitionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）

化学键合相色谱法（BPC）亲和色谱法（AC）胶束色谱法（MC）手性色谱法（CC）基本类型色谱法一、液固吸附色谱法（LSC）

liquid-solidadsorptionchromatography

流动相为液体，固定相为固体吸附剂

1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等2.影响容量因子k的因素

在色谱柱一定（S与Vm一定）及柱温一定时，k与溶质、溶剂的性质有关。在吸附色谱法中，硅胶是最常用的吸附剂，故以硅胶为例讨论

⑴硅胶与溶质分子的亲合力顺序（容量因子序）：饱和烃＜芳烃＜有机卤化物＜醚＜酯≈醛≈酮＜醇≈胺＜羧酸与硅胶亲合力大的溶质，k大，tR‘（或tR）大，晚出柱⑵流动相的极性常用流动相以烷烃为底剂，加入适当极性调整剂组成二元或多元溶剂系统流动相系统极性越大，洗脱力越强，容量因子ｋ越小，tR越小。调整溶剂的极性，可以控制组分的保留时间。2/5/2023续前（3）固定相硅胶的活性5.其他固定相：高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物3.适用：分离极性化合物硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小，吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%，硅胶失活→载体，吸附的水→固定液，分配色谱4．出柱顺序：硅胶极性较大，强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱二、液液分配色谱法（LLC）1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用

3．正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分4.反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（BPC）（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（reversedbondedphasechromatography,RBPC）（三）正相键合相色谱（normalbondedphasechromatography,NBPC）（四）离子对色谱（五）离子抑制色谱（了解）（一）化学键合相定义：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面，而构成化学键合相1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：

1）不易流失

2）热稳定性好

3）化学性能好，pH介于2~8范围内溶液中不变质

4）载样量大

5）适于梯度洗脱

6）应用范围广（正相、反相、离子对色谱等）（二）反相键合相色谱法1、分离机理：疏溶剂理论为代表溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。2、影响因素溶质分子中非极性部分的总表面积，k，tR

键合相中烃基的总表面积，k，tR

洗脱液表面张力（含水量↑），k，tR

3.反相色谱中影响溶质保留的因素：（1）反相键合的烃基链长；（2）有机溶剂的比例；（3）流动相的pH；（4）流动相的盐浓度。续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱法

1、固定相：极性键合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）2、流动相：类似与以硅胶为固定相的吸附色谱法非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）3、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等（四）反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离模型1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸2）影响k的因素离子对试剂的种类：碳链长度增加，溶质的k增大；流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。3）适用：较强的有机酸、碱反相离子对色谱法模型33++()+3s3(+固定相：弱极性+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH离子对mB+ABAmA(s流动相：极性通式（五）反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质或pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：选择流动相：应同时考虑极性及pH值酸性物质——加入酸HAc

tR↑，k↑

碱性物质——加入碱NH3·H2OtR↑，k↑调节pH范围：3.0~8.0

pH>8.0破坏键合相与载体的结合

pH<3.0腐蚀柱子3）适用：弱酸、弱碱物质

pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物第四节固定相一、固定相——要求：颗粒细、均匀、球形、耐高压

1.液-固色谱固定相硅胶：薄壳型；无定形全多孔硅胶(YWG)；

球形全多孔硅胶（

YQG）

2.化学键合相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面，而构成化学键合相非极性键合相：十八烷基键合相（ODS或C18）是最常用的非极性键合相。中等极性键合相极性键合相正相色谱反相色谱吸附色谱

第五节流动相（溶剂系统）对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。pH介于2~8范围内。对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内（可用范围）或2~5（最佳范围），

k小，tR小；k大，tR大，峰宽变大；与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效。

2/5/2023（一）流动相对分离的影响（分离方程式）（二）流动相的极性和选择性流动相的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强流动相的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同吸附色谱：同经典LC，二元或三元的有机溶剂，粘度小正相色谱：同吸附色谱法反相色谱：水-有机溶剂，粘度小，无UV吸收常用水-甲醇或水-乙腈续前

（三）洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）——类似GC的等温度洗脱以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求2）梯度洗脱：——类似GC的程序升温在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵）。适于分析极性差别较大的复杂组分缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度有时引起基线漂移、重复性较差峰的鉴别：1．苯；2．氯苯；3．对二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脱两种洗脱方式的比较（b）等度洗脱2/5/2023（四）溶剂系统选择的一般原则RBPC流动相极性越强，洗脱能力越弱，溶质的k越大（1）溶剂种类：水+甲醇、水+乙腈（2）溶剂比例：水的比例增加，使k增大（3）溶剂pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂（色谱纯）作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。一、输液系统高压输液泵恒压泵：流量精度不稳恒流泵（常用）：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式第七节高效液相色谱仪输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀2/5/2023二、色谱柱和进样系统

进样器注射器进样阀（六通阀，不停泵进样）、自动进样装置色谱柱（column）由柱管（不锈钢管）和固定相组成分析柱（直径4~6mm，柱长10~30cm）、制备柱柱效评价：色谱系统适应性试验

R≥1.5，n（符合规定），fs（0.95~1.05）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗（了解）2/5/2023三、检测器

1、紫外检测器：适于吸收紫外光的物质

检测原理：朗伯－比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl特点：灵敏度较高（10-6—10-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。专属型、浓度型检测器续前紫外检测器类型：1）固定波长检测器：254nm2）可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200—400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似3）光电二极管阵列检测器(DAD)：在获得色谱图的同时，还可以获得个组分的光谱图。即获得三维光谱－色谱图。用途：吸收