灰色链霉菌产链霉素汇报

灰色链霉菌产链霉素2023/2/51实验背景实验方法实验结果结论讨论ABCDEContents目录2023/2/52一、实验背景

灰色链霉菌是一种放线菌，而高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，可用于培养放线菌。种子扩大培养是发酵工程的一个组成部分，指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。

种子扩培的一般过程是：斜面菌种→一级种子培养（摇瓶）→二级种子培养(种子罐)→发酵。根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。2023/2/53二、实验方法1、灰色链霉菌的活化1.1培养基的制备本实验原计划采用高氏培养基活化菌种，后因效果不佳，改用PDA培养基培养。因此制备PDA培养基。1.2斜面接种1)左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻2023/2/542)左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。4）斜面置于28℃恒温箱中，培养2~3d观察结果。2023/2/552、种子液的制备将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，标记。28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。3、摇瓶大量发酵待发酵培养基（50ml）灭菌后冷却到30℃时，按接种量8%-10%进行接种，即每个发酵瓶加入5ml种子液。32℃、100r/min旋转式摇床培养24h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增加氮源，维持pH值。2023/2/564、枯草芽孢杆菌的活化将配制好的蛋白胨牛肉膏培养基斜面接种枯草芽孢杆菌，方法同灰色链霉菌活化方法相同。28℃培养24h。5、链霉素活性的鉴定5.1枯草芽孢杆菌悬液制备加入1ml生理盐水于枯草芽孢杆菌斜面中，轻轻冲下菌落，取至新的灭菌的1.5mlEP管内，备用。5.2枯草芽孢杆菌悬液的稀释用生理盐水将悬液分别稀释5倍和10倍，备用。2023/2/575.3涂平板将制备好的不同浓度的枯草芽孢杆菌悬液涂布于4个制备好的LB平板，浓度分别为原液、5倍、10倍，第4个平板作为阳性对照，悬液浓度为原液。5.4打孔将涂布好的平板用1ml枪头打3个孔，孔径光滑均一。5.5加样将发酵液取10ml于10mlEP管内，2000r/mim离心5min，取上清加于每个孔内，加满为止，但不能溢出。阳性对照的孔内加入一定浓度的链霉素液。37℃培养12h，观察抑菌效果。2023/2/58实验材料的准备1、实验器材天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、报纸、记号笔、酒精灯、接种环、250/500ml三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环、涂布棒、旋转式摇床、4℃冰箱、37℃孵箱、各型号移液枪及枪头、超净工作台等。2023/2/592、斜面培养基的制备2.1高氏培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）。2.2PDA培养基：淀粉含量高的土豆、葡萄糖、琼脂。将土豆切成小块，煮烂用纱布滤出土豆汁。将1000ml的土豆汁中加入葡萄糖20g，琼脂15-20g。2023/2/5102.3种子液的制备豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2-7.4。2.4发酵液的制备水解糖160g、尿素5g（单独灭菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、玉米浆25~35g、FeSO4和MnSO4各20mg/L，消泡剂0.3g，，水1000mL，pH7.2。2023/2/511三、实验结果1、灰色链霉菌的活化管中可见成片白色菌落，并且管底含有水。2023/2/5122、种子液的制备2023/2/5133、链霉菌的发酵2023/2/5144、枯草芽孢杆菌活化由于斜面培养基太软，划线的时候破坏了培养基，菌落也成片。2023/2/5155、链霉素的活性鉴定测得抑菌圈直径为1.2cm1.2cm,1.4cm平均值为1.27cm枯草芽孢杆菌原液涂板所得抑菌圈图片2023/2/516枯草芽孢杆菌稀释五倍涂板所得抑菌圈图片测得抑菌圈直径为1.7cm，1.4cm,1.5cm平均值为1.53cm5、链霉素的活性鉴定2023/2/517测得抑菌圈直径为1.8cm，1.4cm,1.5cm平均值为1.57cm枯草芽孢杆菌稀释十倍涂板所得抑菌圈图片5、链霉素的活性鉴定2023/2/518阳性对照，枯草芽孢杆菌原液涂板所得图片平板上未见预期结果，即透明的抑菌圈，培养基上也未长菌。5、链霉素的活性鉴定2023/2/519四、结论通过活化灰色链霉菌并将其大量发酵，离心获取产物即链霉素；通过打孔加入链霉素，观察其抑菌圈大小判断链霉素的效价，可评价制得链霉素的活性。2023/2/520五、讨论1、由于考虑到链霉素的抑菌效果，我组采用不同倍数稀释的枯草芽孢杆菌悬液。2、此次实验未取得理想的实验结果，可能原因如下：