第九章 凝胶过滤及

第九章凝胶过滤及离子交换层析介质广东省韶关学院生物科学系

第一节概述自茨维特1903年发明色谱法以来，该方法已经广泛用于生物分子的分析分离与制备。在蛋白质、多糖、天然产物的分离纯化与除热源等方面得到了广泛的应用。其中的填料——色谱介质，是决定色谱分离效果的主要、最重要的因素。目前，各个国家的许多公司，均有专门的色谱出售。有的用于分析效果好，有的适合大规模制备使用。60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的研制成功，使色谱实现机械化、自动化操作，提高了操作的复现性。这类全自动的生产规模级的层析系统（如瑞典Pharmaciacom.的BioprocessⅠ、），能高速处理大量样品，流速从4-20L/h到40-400L/h，能满足各类规模生产的需要。他们的填料特点是：1、适用于实验室和大规模生产，重现性高。2、易清洗、消毒和再生，理化性质稳定，使用寿命长。3、易装柱，高工作容量，高流速，利于工业化生产。1975年Small提出了离子交换色谱法，1981年Jorgenson创立了毛细管电泳法。20世纪90年代后，出现的扩张床吸附技术，通过一步纯化，达到萃取、浓缩和初步纯化的目的，所用的填料是STREAMLINE介质——一种以Sepharose为基架的介质。2004年GEHealthcare(原安玛西亚公司)推出的新一代EBA扩张柱STREAMLINEDirect柱，消除了样品和气泡容易堵在筛网下的问题。各种用于大规模大分子分离纯化生产的色谱方法见表9-1，需注意他们的分离原理、特点和应用。类型机理优点缺点适用范围离子交换静电吸附操作简便，分辨率高，流速快，容量高易受离子干扰大量样品处理凝胶过滤分子大小排阻效应分辨力中等，不会引起变性，流速低，容量有限各种凝胶介质昂贵，处理量有限制适合脱盐，去热源和纯化的最后步骤疏水色谱疏水性分辨力高，重复性较好，体积不受限影响因子多适合纯花的各个阶段亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高，流速快，容量大，体积不受限一种配体只能用于一种生物大分子适合纯花的各个阶段聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高，流速快，容量大进口试剂昂贵纯化的后阶段第二节凝胶过滤介质一、凝胶过滤概念：又称排阻层析或分子筛方法，是利用凝胶网状结构，根据分子的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化的方法。凝胶过滤的优点：①介质稳定，不带电，不与溶质反应，蛋白质不易变性。②适应面广，对各种大小的分子均适用。③设备简单，易操作，耗时少，可连续操作。常用于脱盐和分级分离。分级分离是将分子大小相近的物质分开，且要选择合适的凝胶，单次上样量小，一般为床柱体积的5%-10%。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开二、凝胶介质应具备的条件优良的凝胶介质是获得良好分离效果的前提，介质必须：1、惰性材质，不与溶质和溶剂反应。2、没有或极少的非特异性吸附，提高回收率。消除带电基团。3、介质内孔径大小分布均匀，孔径分布要窄，才能保证分离效果好。4、凝胶珠大小均匀，均一性好。细粒填料能提高柱效。5、机械强度高，易于消毒，能反顾使用。三、凝胶介质的种类主要为人工合成大分子和天然多糖类1、多糖类骨架这类多糖有纤维素、葡聚糖和琼脂糖这类介质生物相容性好，亲水性强，不会导致生物分子变性失活。由琼脂糖和葡聚聚合而成的糖新一代复合凝胶——Superdex高效过滤介质，使生产效率进一步提高，从小规模过滤延伸到大规模生产。2、合成大分子骨架介质这类介质有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系和含羟甲基酰胺类等。克服了天然介质易受微生物侵蚀的缺点，保留了多糖骨架亲水的优点。3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质既亲水抗微生物侵蚀，又有很好的生物相容性和刚性。凝胶层析分类

分类原则类型特征据溶质分子与固定相相互作用的机理不同吸附色谱离子交换色谱疏水作用层金属螯合色谱共价作用色谱分配色谱凝胶过滤亲和色谱吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同据实验技术

低压色谱中压色谱高压色谱电泳操作压力小于0.5MPa操作压力在0.5～5MPa之间操作压力在5～40MPa之间溶质分子在电场中的移动速度不同据固定相的形状不同柱色谱纸色谱薄层色谱固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相在玻璃平板上铺成薄层据流动相的物态不同

气相色谱液相色谱超临界流体色谱流动相为气体流动相为液态流动相为液态按操作方式不同

迎头法顶替法洗脱法将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分都不能达到分离。利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。系列名称

分离范围

颗粒大小

应用

Superdexprepgrade系列

Superdex30PG

小于10000

24~44微米

小肽

Superdex75PG

3000~70000

24~44微米

一般蛋白

Superdex200PG

10000~600000

24~44微米

单抗、大分子蛋白

Superose系列

Superose6PG

5000~5000000

20-40微米

蛋白、多糖、核酸、病毒

Superose12PG

1000~300000

20-40微米

蛋白、多糖、核酸

SephacrylHR系列

SephacrylS-100

1000~10000

25-75微米

肽类、小蛋白

SephacrylS-200

5000~250000

25-75微米

一般蛋白

SephacrylS-300

10000~1500000

25-75微米

抗体等较大蛋白

SephacrylS-400

~28000000

25-75微米

多糖、蛋白多糖、脂质体

SephacrylS-500

~60000000

25-75微米

<1078bp的DNA片断

SephacrylS-1000

~100000000

40-105微米

<20000bp的质粒、巨大多糖、病毒

SepharoseFF系列

Sepharose6FF

10000~4000000

45~165微米

质粒、病毒

Sepharose4FF

60000~20000000

45~165微米

病毒，rHBsAg等巨大分子

Sepharose

xB（CL-xB）系列

Sepharose2B

70000~40000000

60-200微米

大分子复合物

Sepharose4B

60000~20000000

45-165微米

病毒等大分子

Sepharose6B

10000~4000000

45-165微米

大分子SephadexLH系列

SephadexLH20

100-4000

30-100微米

天然产物

SephadexLH60

400-20000

40-120微米

天然产物

Sephadex系列

SephadexG-10

小于700

40-120

SephadexG-15

小于1500

40-120

SephadexG-25coarse

1000-5000

100-300

脱盐及更换缓冲液用

SephadexG-25medium

1000-5000

50-150

SephadexG-25fine

1000-5000

20-80

SephadexG-25superfine

1000-5000

10-40

SephadexG-50coarse

1500-30000

100-300

小蛋白、多肽的分离

SephadexG-50medium

1500-30000

50-150

SephadexG-50fine

1500-30000

20-80

SephadexG-50superfine

1500-30000

10-40

SephadexG-75

3000-80000

40-120

一般蛋白的分离

SephadexG-75superfine

3000-70000

10-40

SephadexG-100

4000-150000

40-120

较大蛋白的分离SephadexG-100superfine

4000-100000

10-40SephadexG-150

5000-300000

40-120

大蛋白的分离SephadexG-150superfine

5000-150000

10-40SephadexG-200

5000-600000

40-120

大蛋白的分离SephadexG-200superfine

5000-250000

10-40

四、凝胶过滤注意事项凝胶过滤常用于下游产品最终纯化步骤。填料选择：根据样品中组分情况，选择分离范围与分子量相近的介质。组分多，大小分布广的样品应选分离范围广的介质；成分简单的样品选择分辨率高的凝胶。如需处理大量样品，要选择粒度较大，流速较快的介质，要精细分离的，选粒度小分辨率高的介质。装柱：均匀搅拌一次倒入柱中，不能有气泡和分层。为确保柱效，可用1%丙酮、兰色葡聚糖等测定柱效。加样：不能冲动凝胶表层，每次控制样品5%V。体积小分辨率高。为减少非特异性吸附，可在缓冲液中加一定浓度的盐，0.1-0.2MNaCl。第三节凝胶过滤介质的主要品种一、葡聚糖系列Sephadex1、结构以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶，孔径大小取决交联度。按孔径不同形成G系列凝胶。葡聚糖结构G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表持水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示1g干胶持水10mL，依次类推。2、性能①溶胀性能吸水膨胀，商品以干粉供应。②化学稳定性不溶于一切溶剂，在水、盐、碱和弱酸中稳定。③物理稳定性pH近中性时耐高压高温，所以可以高压灭菌。④机械强度各种G系列凝胶均有一定机械强度，能承受一定压力，机械强度大小取决于交联度。3、主要用途小孔径凝胶用于脱盐与小分子分离，大孔径凝胶用于蛋白质、核酸等大分子分离。4、衍生物葡聚糖结构中引入-CH2-OH（羟丙基）即成为LH系列凝胶。引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-SephadexA）等。用途更广，可用于脂类，激素和维生素等小分子分离，也适用于有机溶剂和极性有机溶剂缓冲液。LH系列的用途：①用于有有机溶剂的凝胶过滤②结合了凝胶过滤、分配色谱和吸附层析的特点，适用于其他凝胶难处里的样品，能分离结构非常相似的分子。③排阻极性与母体凝胶相同。④高负载长寿命，高分辨率，可载样300mg/ggel。（书本P167列出了它们的性能参数）二、琼脂糖系列琼脂糖凝胶（agarosegel）由经过纯化琼脂糖制备的。可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构为：β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。

琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。

瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。

美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。英国的称为Sagavac，又分为Sagavac2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2％，4％，6%，8％和10％；百分数表示干胶量。琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3mol/LEDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。1、Bio-gelA系列Bio-rad公司产，pH适应范围广，4-13均有效。具体参数见表9-4（P168）2、Sepharose是应用最广，型号最多系列。性能见书P169表9-5。1）、Sepharose

最早的产品，为非交联结构。需在2-40℃使用，渐被淘汰。2）、SepharoseCL是琼脂糖珠体与2，3-二溴丙醇交联而成，经碱水解除去硫酸根，减少了非特异性吸附。可120℃高压，也能用作离子交换剂和吸附剂。3）、Superose

珠状琼脂糖2次交联制备的。提高了产品的刚性，增强了理化稳定性。分离范围更广，分辨率更高。颗粒细小，刚性强粒度均匀，柱效高，可容许高流速，适用于中、高速层析系统。用于糖、核酸、病毒、变性剂中的蛋白质纯化。4）、SepharoseFastFlow高度交联的琼脂糖凝胶，高机械强度，高流速。性质稳定，非特异性吸附低，产物回收率高。三、聚丙烯酰胺系列聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号（孔径）的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的结构

在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在pH2～11的范围内使用。商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-GelP-2至Bio-GelP-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-RadLaboratories生产并出售多种规格的Bio-GelP。四、Sephacryl

系列由烯丙基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺聚合交联而成。易装柱，流速高，分辨率高，稳定。样品体积适应广，从几um到几千L均能用。五、Superdex

系列最新的凝胶介质，由葡聚糖以共价方式与高交联的琼脂糖珠结合形成的符合凝胶。刚性强分辨率高，pH适应性广，产物回收率高，性质稳定。六、聚乙烯醇系列聚乙烯醇系列Toyopearl以交联聚乙烯醇为骨架构成的凝胶介质，产生于1980 s年代。多孔的三维网状结构，大分子链上含许多-OH基团，亲水性强，与生物分子相容性好，常作为固定化酶的载体。七、Bio-BeadsS-X系列以多孔苯乙烯和二乙烯苯交联形成的共聚物，适用于疏水性物质和非水体系，以此为母基构成相应的离子交换剂。具体性能见书P172，表9-10。第四节离子交换法及离子交换剂的选择一、离子交换法离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂可交换的离子进行交换，达到分离纯化的技术方法。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。该方法具有分辨率高、工作容量大、易于操作的特点。在生化分离中75%的工艺采用了离子交换法。选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，这两种物质就可被分离。带同种电荷的不同离子虽都可以结合到同一介质上，但由于带电量不同，与介质的结合牢度不同，改变洗脱条件可依次被洗脱而达到分离的目的。离子交换剂是一类能显示离子交换的功能高分子材料。分为无机离子交换剂和有机离子交换剂。无机离子交换剂有机离子交换剂沸石、磺化煤离子交换树脂离子交换长期以来应用于水处理和金属的回收。在生物工业中，由于离子交换法分辨率高、工作容量大且易于操作，几乎所有的生物分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换法已广泛用于生物分子的分离纯化技术。主要应用在抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的提取分离。近年来在蛋白质等生物大分子的分离提取也有应用。离子交换树脂的出现已有近80年的历史.离子交换树脂发展史上的3个重要阶段1933年Adams和Hofms发明了缩聚类酚醛型阳、阴离子交换树脂,二战及二战后期离子交换树脂大发展

1939年德国法本公司和1941年美国的树脂产品和化学品公司先后开始工业生产，在第二次世界大战中，美国获得了苯乙烯系和丙烯酸系加聚型离子交换树脂合成的专利。它开创了当今离子交换树脂制造方法的基础。离子交换树脂的发展50年代以后，开展了膜状离子交换树脂的研究,开辟了电化学的新领域。50年代末，60年代初期,又研制出耐压、耐磨、高交换速度、能交换或吸着高分子量化合物的大孔离子交换树脂。70年代以后，出现了各种大孔吸附树脂及特种树脂。

我国在1950年以后开始离子交换树脂的研究，

1956年何炳林提出并合成了大孔型离子交换树脂

1958年，离子交换树脂在国内正式投入工业化生

其结构由三部分组成：1.不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；2.是与骨架相联的功能基团；3.是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交换现象。功能基团与可交换离子所带电荷相反，以静电作用，可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子。反离子可与溶液中同种电荷离子进行交换，交换反应可逆，故离子交换剂和反复使用。操作方式有2种，1为正吸附，即将目的产物离子化吸附到介质上，杂质不被吸附而从柱中流出；产物纯度高切被浓缩，适用于产物浓度低的且液体量大的溶液。2为反吸附，就是将杂质吸附到介质上，产物不被吸附而从柱中流出；所得产物纯度不高，适用于产物浓度高的溶液。操作方法有间歇式分批操作和柱式操作2种。间歇式分批操作又称静态处理，是将离子交换剂浸泡在工作液内，达到平衡后滤出介质进行洗脱。柱式操作也称动态法，交换、洗涤、再生均在离子交换柱内进行，也叫离子交换色谱法。二、生化用离子交换剂的特点1、亲水性和生物相容性离子交换剂均具有较好的亲水性和生物相容性，骨架则有的亲水有的疏水，亲水的在水中可溶胀成水溶胶，不与生物分子反应。2、孔结构介质孔穴有3种，①凝胶孔，经交联大分子链间成孔，干态时柱体内无孔隙，②大孔树脂介质孔，在有机溶剂存在时进行聚合，干湿状态下均存在，最大直径达2.5×104-5×104nm。③琼脂糖介质孔，大小随琼脂糖浓度而定。这种介质兼顾分子筛和离子交换作用。3、电荷密度生物大分子常有多个带电点，能与多个功能基结合。这种多点结合与无机物（1︰1）结合不同，结合更牢，不易洗脱，造成不可逆吸附，故电荷密度适度才有利生物大分子分离，而不是密度越大越好。4、粒度粒度越小，分布越均匀，分离效果越好。粒径越小，交换速度越快，因生物分子在珠内路径越短。5、纯度①工业级用于纯度不高用量很大的工艺过程。②分析级经有机溶剂、螯合剂和高纯度酸碱处理后的介质。用于分析实验。③生物技术级粒径小，分布均，适用一般生化分离和去离子操作。④分子生物级也叫无DNA级不存在核酸内切酶、外切酶及连接酶抑制剂。三、生物大分子离子交换的机理与交换剂的选择1、蛋白质带电性决定对交换剂的选择（阳/阴离子交换剂），蛋白质带电性决定于溶液pH值。2、离子交换剂强弱对酸性/阳离子交换剂，pK越小酸性越强；碱性/阴离子交换剂，pK越大碱性越强。低pH（<3）时应选择强酸性介质，高pH（>10）时应选择强碱性介质；电荷密度特别高的分子应采用弱离子交换剂，以避免不可逆吸附。3、螯合分离介质选择含螯合基团，能与金属离子螯合的分离介质即螯合分离介质。使用于含金属离子的蛋白质或除去产品中的金属杂质。4、选择适宜工作条件，提高工作容量全交换容量每克干介质/每毫升湿介质所具有的功能基的含量。工作容量每克干介质/每毫升湿介质在一定操作条件下交换吸附蛋白的实际容量，也叫有效容量或动力学容量。受溶液种类、pH、流速及杂质等影响的可变参数。可见，功能基的多少决定交换能力的大小，功能基种类决定其电性能。四、离子交换分离介质使用应注意的问题1、预处理酸、碱或有机溶剂，使之转变成所需的离子型2、装柱均匀无气泡和分层。3、流速影响吸附、洗脱效果，洗脱以慢速较好。4、适当的洗脱与再生方式将颗粒内、外表面吸附的分子解吸下来。由于溶液中不止一种蛋白，故常改变洗脱条件洗脱。5、消毒与树脂复苏高品质生物制品要求对分离介质消毒，除去微生物等混入其中。对交换容量下降的介质则进行复苏，恢复交换能力。清除介质中的“毒素”，使其恢复工作能力的过程就是复苏。第五节离子交换剂的种类生化分离型介质按介质骨架分有天然多糖骨架和人工合成/半合成的介质。目前国际上有100多个有关介质品牌和品种。80%用于水处理。一、通用型离子交换树脂功能基种类能用于水处理、湿法冶金、化学合成和医药工业等用途广泛的离子交换树脂叫通用型树脂。强/弱酸性、强/弱碱性、螯合型；凝胶型、大孔型；按合成的单体分有苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系等。参考书P178表9-12二、通用型树脂常用牌号用于从发酵液中分离有机酸、抗生素、氨基酸和天然产物提取等。见书P179表9-13和9-14。三、生化专用离子交换剂主要用于生化领域，其他领域使用很少，粒度较小的分离介质。目前还是以多糖类骨架为主，一般