高效液相色谱方法

高效液相色谱方法及应用液相色谱的发展史液相色谱的基本概念高效液相色谱的具体操作（Aglient1100）本实验室应用HPLC的实验总结历史回顾1906年，俄国植物学家Tswett（茨维特）用碳酸钙作为吸附剂，分离干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜色六条色带，他把这种色带称为“色谱”；属于液固色谱。1940年，Martin和Synge提出了液液分配色谱；1941年提出了气相色谱可能性；1949年，Macllean制作薄层色谱板1952年，Martin和Synge发展了气相色谱，并获得诺贝尔奖。60年代末，出现商业高效液相色谱（HPLC),但是由于泵、检测器的发展滞后，使得HPLC在80年代以后才得以迅速发展。经典的LC色谱（柱色谱）经典LC特点：仅做为一种分离手段（1）柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀（2）常压输送流动相（3）柱效低（H↑，n↓）（4）分析周期长（5），仅靠肉眼观测，且无法在线检测HPLC的特点HPLC：分离和分析（1）柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）（2）高压输送流动相（3）柱效高（H↓，n↑）（4）分析时间大大缩短（5）靠仪器在线检测HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置第五节高效液相色谱仪（Aglient1100）1.真空脱气机工作原理：使用半透膜管路，允许气体分子通过，液体分子无法通过作用：(1)可以有效地降低噪音（2）保证保留时间具有更好的重现性2．泵

类型：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用自动进样器1．进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）

GC系统压力较小，可以

HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀2.优点：1.在标准进样范围内（0.1~100μL),具有良好的重现性和精确度2.自动进样针尖取样位置可设为负值（－2.5mm）

4.柱温箱作用：溶剂管路先在柱温箱中预热，然后才进入柱子，保证了温度的稳定性。也意味着保留时间的重现性得以保证。3.色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm

柱效评价：色谱系统适应性试验

R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4．检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质1.可见波长检测器（VWD)特点：在某一时刻仅可得到某一波长下的吸光度值；将各个时刻所得到的吸光度值描点作图，即可得到所需的色谱图。（拥有一个VWD检测器）2.二极管陈列检测器（DAD）特点：可得到任一时刻各个波长下的吸光度值，即可以得到样品在各个时刻的吸收光谱图；同时DAD还具有峰纯度检测的功能，用于初步判断所得色谱峰是否为纯净物的流出物。（拥有两个DAD检测器）3.色谱图与光谱图的区别：色谱图是某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作图；光谱图是某一时刻各个波长下的吸光度值描点作图。

3.荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高其他检测器：折光指数检测器（RID）、电导检测器（ECD）近几年出现的蒸发激光散射检测器（ELSD）有望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量检测器.。四、HPLC的特点和应用

“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）第四章建立高效液相色谱分析方法的一般步骤通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。