显微荧光检测及钙成像技术

-荧光的基础知1、荧荧光是冷光，颜色为荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和 荧光的发光原2、荧光的发光原 由光激发引起的荧光由光激发引起的荧光—由化学反应引起的荧光—由X射线引起的荧光—X由激光引起的荧光—化学荧光在有生命的生物体中产生— 荧光色素的性1、激发光波长和发射光

2、激发光谱和发射激发光谱（吸收光谱）：激发光谱（吸收光谱）：通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发2、激发光谱和发射光谱的荧光强度。在λex两侧激发波长范围λ1－λ2所对应的是强发射荧光区域，即3、荧光稳定4、组织细胞的自发常用的荧光探 荧光探针的类

荧光成像的应

1、钙离子有机荧光2、以蛋白为基础的钙离子荧光探钙生物传感器：Cameleon（enhancedcyan-fluorescentproteinorECFPyellow-fluorescentproteinorYFP）Calciumgreen‐dextran显微注射进入百合花粉原生，研究CaM和CaM‐conjugatedquantumdot(QD)对胞内钙离子浓度的影响（WangQ,etal.JBiolChem.,284(18):12000‐7） 其他金属离子的荧光探1、Mg2+MagnesiumGreenIndicator（可见光激发

J.Am.Soc.,2006,1281、Zn2+例如：FluoZinChimActa.2014,826:pHpH1、荧光素及衍生比。在生理pH范围内（pH6.4－pH7.4），BCECF的比例荧光与pH2、半萘酚罗丹荧激发激发光谱为pHpH值，也可用其某一波 （JolanaT.PAlbrechtová,etPlantPhysiologyandBiochemistry, 细胞器荧光探线粒体荧光探针——Mito ，JC-1，Rhodamine溶酶体荧光探针——LysoTracker®&Lyso ，DAMP，Neutral内质网荧光探针——ERTracker ，NBDCeramide,BODIPY 细胞骨架荧光探G-肌动蛋白荧光探针——荧光标记的DNase微管选择性紫杉醇探针——BODIPYFL （HeLacellswerestainedwithCF555phalloidin(red),mouseanti‐α‐tubulinfollowedbygoatanti‐mouseCF488AIgG(green)andDAPI(blue),respectively.）胞膜透过性核酸荧光探针（用于细胞染色非透过性核酸荧光探针（用于DNA琼脂凝胶电泳PremoTMgeminin–GFPG2/MPremoTMCdt1–RFPG1/S 氧化应激检测：CellROX®试色Deep是可不是不是可可第三部荧光成像中的常见问题和解 荧光的淬灭和抗淬1、荧光的淬 荧光的淬灭和抗淬2、荧光的抗淬 荧光的淬灭和抗淬AlexaFluor488VSfluorescein 荧光的淬灭和抗淬TheAlexa 荧光的非特异性结2、固定细胞成像中荧 与细胞组分的非特异性结封闭液或BSA不起作用。使用Image－IT®FXSignalEnhancer抑制荧光带来的非特异性背景3、消除活细胞成像中的背景第四部显微荧光检测技 荧光成像种1、荧光染用对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被

2、免疫

免疫荧 免疫酶组织化Ab2

卵白素

Ab-

生物素化

生物素ABC复合IF：1Ab+2Ab-fluorescencedye3、荧光蛋白表GFPpositivemotorneuronewithadultzebrafish.

35s(plasma

35sH2B: 技术种 技术比 Time-lapse动态成 分辨率成像技术对术20-10-区域使用较强激光，可使用有机，生物样易做活细胞测的定位为力

第五部激光共聚焦显微镜及图ZeissZeissLSM710 共聚焦原共焦显微镜与传统显微镜的

0.20.250.180.240x40x/1,340x/1,3

40x/1,340x/1,3

WideWide（加黑的虚折线）正对，另一个（浅色虚折 图像扫描方Max.Scanned

图像扫描策1、扫描速Speed：控制成像速度，速度越慢，到的信号 Framespersecond：会影响时间分辨率2、Z- Z-d物镜数值孔径共聚焦针孔的直径光的波长介质折射率

d=Pn/CCD3、信噪1降低扫描速度：控制成像速度。速越慢，增加图像上每个象素点的停留 4、扫描方FlyBackBlanking,Zoom FlyBackBlanking,Zoom FlyBackBlanking,ZoomRotation

FlyBackBlanking,ZoomRotation45°,X,YBi‐directionalScan,Zoom Bi‐directionalScan,ZoomRotation

FastestFastestswitchingbetweentracks‐SwitchTrackeveryLine+双通道往返扫描，速度最5、光谱交叉问题（cross Alexa488andAlexa

488

561 Alexa488

Alexa488Alexa488Alexa546detection

AlexaAlexaAlexaAlexa在用Alexa488和Alexa546标记生物样品时，我们同时用488和561激发扫描，AlexaAlexa488Alexa488 detection

AlexaAlexa

+ 叠+ Bestcompromise：为6、如何拍出一张好 灰度值256 0DigitalGain：信号电子放大，增大则信号和噪音都增强，减小则信号和GainDigitalDigitalOffsetatDigitalOffsetatLossofdynamicDigitalOffsetat丢失信DigitalDigitalDigital0Digital1Digital0Digital第六部实时定量测定细胞内Ca2+的变实时定量测定细胞内Ca实时定量测定细胞内Ca2+1、细胞的钙转移 实时定量测定细胞内Ca2+的变2、显微荧光测钙的fura-2仅5ms，而微电极测量需要几秒，NMR法则需 实时定量测定细胞内Ca2+3、钙荧光探针分

定量探（双波长指示剂非定量探（单波长指示剂

Indo1，FuraFluo3/Flou4、Fura2,IndoFluo3/Fluo4、CalciumGreen、CalciumOrange 实时定量测定细胞内Ca2+的变4、钙荧光探针的钙探针的化学结构：酸化、酯化、葡萄糖 的作用下水解,恢复为不能通过细胞膜的游离酸形式,进而与细胞内钙结合检测目实时定量测定细胞内Ca实时定量测定细胞内Ca2+根据解离常数（Kd）选择合适的探度范围是(0.1～10)×Kd。但其敏感的范围却是接近或略低于Kd。实时定量测定细胞内Ca实时定量测定细胞内Ca2+5、影响显微荧光测钙的细胞内缓钙荧光探针可作为细胞内钙的缓冲剂，探针的Kd高,达到饱和的负载量越高,对细胞内钙的缓冲作用也越强,可能使测定的钙代表有Fura2、CalciumGreen1、FuraRed 实时定量测定细胞内Ca2+的变区域 转运抑制剂(如丙磺舒、苯磺唑酮)等 实时定量测定细胞内Ca2+的变渗 ,例如钙绿由于比Fura2多一个正电荷,其渗漏现选择抗渗漏 ,如FuraPE3、IndoPE3、FluoLR等 实时定量测定细胞内Ca2+的变6、双波长指示它的数据形式采取比例的方式,不受实验设备、光路组成、 光(340nm)激发产生FURA-2

1、激发波长380nm（Fura2）和340（钙离子-Fura2），发射波长5102、340nm380nm 实时定量测定细胞内Ca2+的变6、单波长指示 但其数据直接为荧光强度值,易 Indo-1具有单波长激发,双波长发射nm无钙时的475nm变为钙饱