基因工程的基本操作程序2016512

知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游：能编码蛋白质编码区非编码区：由编码区上游和编码区下游的DNA序列组成，不能编码蛋白质。有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子：能编码蛋白质编码区非编码区：由编码区上游和编码区下游的DNA序列组成，不能编码蛋白质。有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA短片段，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶:由多个肽链构成的蛋白质。能够识别调控序列中的结合位点并与其结合，催化DNA转录为RNA。编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：知识点一：2.真核细胞的基因结构非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取

什么是目的基因？主要是编码蛋白质的基因；也可以是一些具有调控作用的因子。

获取目的基因的常用方法有哪些?

从基因文库中获取目的基因

利用PCR技术扩增目的基因

用化学方法人工合成目的基因一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.基因文库的分类:只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。含有一种生物的全部基因基因组文库：部分基因文库：一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.基因文库的分类:3.怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？据目的基因的有关信息，获取目的基因。一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.什么是基因文库？2.基因文库的分类:3.怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？4.怎样构建基因文库？求异思维你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？寻根问底1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。一、目的基因的获取（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR：（1）概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术多聚酶链式反应体外特定DNA片段（2）PCR技术是由________等人于_____年发明的，为此1993年获得____________奖穆里斯1988诺贝尔化学（3）原理：DNA双链复制PCR的原理（DNA体内复制相关知识）项目相关内容与作用时间有丝分裂、减数分裂间期场所细胞核线粒体叶绿体酶DNA解旋酶使氢键断裂，打开DNA双链DNA聚合酶催化合成DNA子链模板DNA母链提供复制模板原料脱氧核苷酸合成子链的原料引物使DNA聚合酶能够从引物的3/端开始连接脱氧核苷酸条件：引物：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3`端延伸DNA链。因此复制需引物一、目的基因的获取（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR：（1）概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术多聚酶链式反应体外特定DNA片段（2）PCR技术是由________等人于_____年发明的，为此1993年获得____________奖穆里斯1988诺贝尔化学（3）原理：DNA复制（4）前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。条件：引物：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上(从3`端延伸DNA链)。因此复制需引物模板DNA：dCTP、dATP、dGTP、dTTP热稳定DNA聚合酶（Taq酶）

变性复性延伸①②③条件PCR技术扩增过程：：当温度上升到90~95℃以上时，双链DNA解聚为单链每个循环包括：：温度下降到55~60℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。：温度上升到70~75℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，根据碱基互补配对原则从引物起进行互补链的合成。变性复性延伸5`3`G—GT—C3`5`A—GC—C5`3`A—G引物Ⅰ5`3`G—G引物Ⅱ变性90~95oC复性55~60oC延伸70~75oCPCR技术扩增过程：5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA55555555每次循环（复制）后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n）。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮2、具体过程PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原则条件不同点解旋方式场所酶结果DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制主要在细胞核内热稳定DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子一、目的基因的获取（二）利用PCR技术扩增目的基因（一）从基因文库中获取目的基因（三）化学方法直接人工合成目的基因（基因比较小,核酸序列已知)二、基因表达载体的构建1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。——基因工程的核心2、基因表达载体的组成：它们各自的作用是什么?复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因三、将目的基因导入受体细胞1.转化：3.转化方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法2.受体细胞易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力植物体受损伤处细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，农杆菌Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：②原理：---采用最多的方法③过程：④优点：经济和有效（2）基因枪法（3）花粉管通道法常用于单子叶植物，成本较高简便经济2、将目的基因导入动物细胞---采用最多、最为有效的方法显微注射法①方法：②受体细胞：③程序：3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：②大肠杆菌细胞最常用的转化方法：四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因----目的基因能否在真核细胞中稳定遗传的关键（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:（一）、检测①提取出转基因生物基因组DNA②用放射性同位素等标记含目的基因的DNA片段作为探针③探针和转基因生物的基因组DNA杂交若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因----目的基因能否在真核细胞中稳定遗传的关键方法:DNA分子杂交2、检测目的基因是否转录出了mRNA----检测目的基因是否发挥功能的第一步方法:分子杂交（注意与上不同之处）3、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原—抗体杂交（二）、鉴定（个体生物学水平）（一）、检测抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳步骤抗虫棉的接种实验基因工程操作流程图小结：寻根问底将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物，此法目前争议颇多，严格讲不算基因工程。思考与探究1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？原因：主要酚类诱导物，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导性）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。3、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4、β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的

处，DNA连接酶作用于

处。（填“a”或“b