河北师大微生物实验五课件

实验五从土壤中分离纯化放线菌一、实验目的1.

掌握配制培养基的原则和方法。2.

掌握微生物分离和纯化的原理和方法。二、实验原理1.微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。方法主要有：简易单细胞挑取法和平板分离法。2.土壤是微生物生活的大本营，是发掘微生物资源的重要基地！放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。3.放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。4.涂布平板法：将含有各种微生物的土壤悬液稀释不同倍数后，涂布接种到平板培养基上，在适宜条件下培养，从中选取放线菌，接种到斜面培养基上进行培养。三、实验材料1.培养基：高氏I号培养基。2.样品：花园2cm深土壤。3.仪器及其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、滴管、试管、培养皿、锥形瓶、枪头、涂布器等。四、实验步骤1.高氏I号培养基的配制及分装2.物品准备3.灭菌4.铺试管斜面，倒平板5.分离6.放线菌纯化7.形态观察1.高氏I号培养基的配制及分装(五组)

高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。（1）配方：

可溶性淀粉40g，NaCl1g，KNO31g，K2HPO41g，MgSO41g，FeSO42mL，琼脂40g，H2O2000mL，pH

7.2～7.4（2）在锅内加入一定体积水后加入可溶性淀粉，加热溶解后，加入无机盐，待水沸腾后，减小火力，加入琼脂粉，溶融后，定容至所需体积。调pH值。（注意：加入琼脂粉后，注意搅拌，勿煮糊。）配1.7L培养基。分装：将上述所制溶液分装入500mL锥形瓶中，250mL/瓶，共5瓶；共1250mL。10mL左右/试管，共42管，共420mL，7个试管一捆（6捆）。1.高氏I号培养基的配制及分装(五组)2.物品准备（分组进行）盛有9mL水的试管，6支（试管用棉塞塞住）在容积为250mL的三角瓶内加入玻璃珠，以盖住瓶底为宜（作用：打散土壤结块），再加入90mL蒸馏水，1瓶试管斜面8支（每组准备好试管和棉塞，第五组准备培养基）平板9个（5个/包，共9包）1mL枪头盒，1盒涂布器8支3.灭菌

将上述培养基和准备的物品于121oC，20~30min高压蒸汽灭菌。4.铺试管斜面，倒平板1.将42根装有培养基的试管斜放，制成斜面培养基。2.倒平板，每个梯度要有一个平行，要有空白对照。5.分离注意：以下各分离步骤均在无菌条件下进行（无菌操作）。（1）称取土壤样品10g，倒入含有90mL水和玻璃珠的三角瓶中振荡5min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了再倒入土样。）（2）无菌条件下，将土壤悬液稀释成10-2~10-7系列浓度。具体稀释过程：用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1mL并加入编号10-2的无菌试管中，震荡混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-7的试管中（每个稀释度换1支枪头）。（3）分别用移液器精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0.2~0.3mL，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小的梯度开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。（4）将上述所涂平板置于28～30℃温度下，倒置培养一周。6.放线菌纯化(1)肉眼观察确认放线菌的菌落。怎么确认？(2)在无菌条件下，挑取单菌落的孢子“之”字划线于试管的斜面上。(3)将试管置于28～30oC的培养箱中培养一周。7.形态观察（1）直接观察（同霉菌）：在培养基中，整体观察放线菌的菌落特征及其颜色。（2）印片观察：取一小块带培养基的菌落正放于载玻片上，然后用另一载玻片加热后按压，注意不要滑动玻片。取上面的印片，有印迹的一面朝上，在40x物镜下观察。如需染色，先将有印迹的载玻片通过火焰2～3次固定，再用美蓝染色观察（染色1min，水洗，干燥后观察）。干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一薄层彩色的“干粉”菌落和培养基的连接紧密，难以挑取菌落正反面颜色常不一致，菌落边缘的琼脂平面有变形的现象……放线菌上图：A：诺尔斯氏链霉菌；B：皮疽诺卡氏菌；C：酒红脂孢囊菌；D：游动放线菌；E：小单胞菌；F：皱双孢马杜拉放线菌下图：A：卡特利链霉菌；B：弗氏链霉菌；C：吸水链霉菌金泪亚种；D：卡那霉素链霉菌；E：除虫链霉菌；F：生磺酸链霉菌玫瑰花链霉菌螺旋形孢子链