第二章高效液相色谱法

第二章高效液相色谱法

HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC第一节概述高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、高效液相色谱仪流程图四、特点一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段

柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相：<1mL/min柱效低（H↑，n↓）分析周期长：例，L170*Ø0.9cm,0.5mL/min,20AA>20h无法在线检测2．HPLC：分离和分析

柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相：1-10mL/min柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短：20AA，<1h可以在线检测二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%续前2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置高效液相色谱仪流程图HPLC装置高效液相色谱仪/v_show/id_XMjQyODk0OTE2.html?from=y1.2-1-87.4.12-1.12-1-2-11视频:高效液相色谱仪原理与操作60%乙氰经20min等梯度洗脱达100%乙氰，保持10min,流速1.2mL/min,柱温:10℃,UV：254nm色谱图续前四、HPLC的特点和应用

“三高”“一快”“一广”高柱效：n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度(<10-9)高选择性分析速度快(<1h)应用范围广泛（可分析80%有机化合物）高效液相色谱的优缺点优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜；第二节基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论——平衡理论基础动力学理论：速率理论——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三、HPLC法中分离条件的选择图示back续前3）传质阻抗项及其影响图示三、HPLC法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min

3.柱温的选择：

选室温250C左右第三节各类高效液相色谱法

一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）一、液固吸附色谱法（LSC）

流动相为液体，固定相为固体吸附剂

1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异竞争吸附：Xm+nSa==Xa+nSm

X—溶质分子S---溶剂分子（m---流动相a---吸附表面）K==[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]nK----吸附平衡常数，即分配系数分离前提：K不等或k不等续前2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）

（2）高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好适用：分离弱极性化合物表孔硅胶（薄壳硅胶）（1）硅胶全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108

堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想

原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物续前3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂

例：正己烷或庚烷+氯仿4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液二、液液分配色谱法（LLC）1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用

固定液——极性→NLLC（正向）固定液——非极性→RLLC（反向）3．正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（BPC）（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（三）正相键合相色谱（四）离子对色谱（五）离子交换色谱（一）化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：1）不易流失2）热稳定性好3）化学性能好4）载样量大5）适于梯度洗脱（二）反相键合相色谱1．分离机制：疏溶剂理论流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，k↑，组分tR↑流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂，洗脱剂）

例：水+甲醇，乙腈，THF（四氢呋喃）续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇续前4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等（四）离子对色谱反相离子对色谱法反相离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分离子与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分离阳离子（分析碱）四丁基季胺盐→分离阴离子（分析酸）2）影响k的因素a．与流动相的极性有关（同反相色谱）b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑3）适用：较强的有机酸、碱（五）离子(交换)色谱利用固定相中离子交换基团与组分离子的交换能力的不同而达到分离的液相色谱。特别适用分析阴离子固定相：阴离子交换树脂流动相：电解质溶液检测器：电导检测器EluentPumpColumnDetectorPumpingSeparationDetectionRecording(Chromatogram）F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-SampleinjectionvalveSuppressorDetectioncellInjection离子色谱仪器构成Column：IonPac

AG12A/AS12A

Eluent：2.7mMNa2CO30.3mMNaHCO3

Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity(ASRSRecyclemode)0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-阴离子分析实例84小结、液相色谱分类和机理1、液液色谱

正相色谱:固定相为极性、流动相为非极性或弱极性的液相色谱。流出顺序:非极性向极性过渡。反相色谱:

固定相为非极性、流动相为极性的液相色谱。流出顺序:极性向非极性过渡。正相离子对色谱:固定相为极性、流动相为非极性或弱极性的并含有适当的有机反离子,这种反离子能与组分形成离子对的液相色谱。流出顺序:按离子对极性大小流出,极性小的先流出。反相离子对色谱:固定相为非极性、流动相为极性的并含有适当的有机反离子,这种反离子能与组分形成离子对的液相色谱。流出顺序:按离子对极性大小流出,极性大的先流出。

小结2、液固色谱固体固定相表面的吸附活性中心对组分的吸附能力不同而达到分离的色谱。

特点:1）.对同系物的选择性小,不利于同系物的分离,而有利于按族的分离。2）.吸附中心的吸附力与分子的几何形状有关,有利于异构体的分离。3）.由于吸附中心主要是表面的硅醇结构,吸附能力大小决定于羟基对组分分子吸附与解吸能力的强弱,因此对流动相含水量要严格控制,方能得到良好的重复性。小结3、离子交换色谱

利用固定相中离子交换基团与组分离子的交换能力的不同而达到分离的液相色谱。R+r-+X-==R+X-+r-

R+r-阴离子交换树脂X-组分离子r-平衡离子4、凝胶色谱(排阻色谱,空间排代色谱)利用固定相凝胶内孔穴大小与组分分子大小而进行分离的一种技术,分子体积大,不能渗透到孔穴内部去,较快流出色谱柱,相反较慢流出色谱柱。

吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化

类型主要分离机理

主要分析对象或应用领域亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析小结、液相色谱分类和机理第四节影响分离的因素1．续前2．对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气续前

3．洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）图示第五节高效液相色谱仪1．输液系统：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用2．进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀续前3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4．检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光检测器高压输液泵

高压输液泵

输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统高效液相色谱仪的结构1高压输液泵

高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。高压输液泵在线脱气装置一、输液系统1高压输液泵柱塞往复泵目前多用柱塞往复泵。续前分析型的柱塞往复泵的容积一般只有0.1～lml，容易清洗和更换流动相。柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响。泵压一般最高为40Mpa(400kg/cm2)。输液的脉动性较大是这类泵的主要缺点。目前多采用双泵补偿法克服脉动性。按泵联接方式分为并联式与串联式，后者较多，因为它可节约一对单向阀。Waters公司等的串联输液泵，两个泵头分别用两个由微机控制的马达驱动活塞运动，可达到无脉动溶剂输出。续前

两个柱塞往复泵串联：泵1的缸体容量比泵2大一倍，两者的柱塞运动方向相反。当泵1吸液时，泵2排液；当泵1排液时，泵2吸取泵1输液的1／2量，另1／2量输出。如此，泵1弥补了在泵2吸液时的压力下降，减小了输液脉冲。

在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。除在线脱气装置外，目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。

脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。2在线脱气装置梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到ABABCC3梯度洗脱装置梯度洗脱装置按多元流动相的加压与混合顺序，可分为高压与低压梯度两种洗脱装置。高压二元梯度洗脱是由两个输液泵分别各吸一种溶剂，加压后再混