原位杂交操作流程

冰冻切片的（DIG-labeledRNAprobe）原位杂交操作程序一、

切片制备用新鲜组织制作6μm厚冰冻切片，37℃干燥1～4小时，进行下一步操作。二、

预杂交前处理预固定：4%PFA（inDEPC-PBSPh7.4）RT30～60min4%PFA：多聚甲醛20g1×PBS450ml

加热（60℃、20min）溶解冷却后调pH至7.41×PBS→500mlPBSRT5min×210×PBS：500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47.7gDEPC水450ml

调Ph至7.5DEPC水加至500mlPBS(含0.3%v/vTritonX-100)RT15min临用前配制

10%TritonX-10015ml1×PBS→500mlPBSRT5min×2第1页/共24页第一页，共25页。消化：2μg/mlProteinaseKinTEbuffer37℃10minTE：

pH8.0Tris-HCl1M5mlpH8.0EDTA0.5M1mlDEPC水→500ml0.2%GlycininPBSRT5min×2

(50xDenhart’s;

Ficoll400聚蔗糖1g后固定：4%PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮1g

BSA牛血清白蛋白1g

DEPC水100ml）

PBSRT3min×2

0.1

M三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐RT5min×2

0.1M三乙醇胺：三乙醇胺2.64mlDEPC水200ml

用前加入乙酸酐500μlPBSRT5min×2第2页/共24页第二页，共25页。三、

预杂交预杂交

50℃2h预杂交液：50%去离子甲酰胺

5×SSC5×Denhardt’s0.02%SDS0.1mg/mltRNA四、

杂交杂交

50℃12h以上第3页/共24页第三页，共25页。

五、

杂交后处理2×SSC脱去盖膜（片）50℃2×SSC清洗37℃10min×220μg/mlRNaseAinRnsaebuffer37℃30minRnsaebuffer;2MTris5ml0.25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8.0DW→1000mlRnasebuffer37℃30min

2×SSC50℃15min×2

1×SSC（含0.02%SDS）37℃15min×25%SDS2ml

1×SSC500ml0.1×SSC37℃15min×2

第4页/共24页第四页，共25页。BufferⅠ37℃10min×2BufferⅠ:2MTris-HClPh7.625ml3MNaCl25mlD.W.→500ml封闭；0.5%抗体阻断液inBufferⅠ（含0.2%Tween20）

37℃20min抗体阻断液:

(1:500抗地高辛抗体in阻断液37℃2h)阻断剂1gTween-200.4ml

BufferⅠ37℃10min×2BufferⅠ200ml

BufferⅡ37℃10min×2第5页/共24页第五页，共25页。

显色；BufferⅡ:2MTris10ml（1:50NBT/BCIPStockSolutioninBufferⅡ2~24h）3MNaCl6.67ml

MgCl22.033g（湿合、避光）

D.W.180ml

浓HCl调pH至9.5D.W.→200ml终止反应：

BufferⅢRT5min×2

流水冲洗

5-10min

1%甲基绿复染3-10min，

水洗，晾干，封固第6页/共24页第六页，共25页。DNA探针检测石蜡

切片中DNA第7页/共24页第七页，共25页。组织标本肝穿刺组织，常规石蜡包埋，4m连续石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58℃烤18h。第8页/共24页第八页，共25页。试剂1．20×SSC2．HBVcDNA-Dig探针5g3．4％多聚甲醛4．0.1mol/LPBS，pH7.45．0.2mmol/LHCl和0.1mol/L甘氨酸PBSpH7.46．0.4％TritorX-100PBSpH7.47．蛋白酶

20g/ml8．0.25％乙酸酐，用0.1mol/L三乙醇胺配制9．预杂交缓冲液和杂交缓冲液10.AKP标记抗DigFab段二抗，可1:500稀释11.TSM、TSM2（配制参阅附录4）12.NBT和BCIP显色液或用AKP显色Kit

第9页/共24页第九页，共25页。操作流程杂交前处理预杂交杂交杂交后漂洗杂交后检测结果判断第10页/共24页第十页，共25页。杂交前处理1.石蜡切片常规脱蜡至水2.0.02MpH7.4PBS洗3×3min3.0.2MHCI20min室温（除去蛋白）4.2×SSC（内含5MEDTA）50℃洗30min5.蛋白酶

2g/ml37℃20min6.0.1M甘氨酸PBS洗10min室温，中止酶反应7.4％多聚甲醛，20min室温8.PBS洗3×3min9.75％，85％，95％和无水乙醇各2min第11页/共24页第十一页，共25页。预杂交和杂交

加预杂交液20l/每片，42℃2h。

加杂交液10～20ul/每片（内含HBV-cDNADig标记探针4g/ml），加盖硅化玻片，将切片置于95℃10min，使探针和靶病毒DNA双链打开（变性），然后迅速置于冰上5min，再将切片置于盛有2×SSC湿合内，42℃杂交过夜(12～16h)。第12页/共24页第十二页，共25页。杂交后漂洗1.将切片置于2×SSC液内振动移去盖片2.2×SSC洗2×10min，55℃3.0.5×SSC2×5min，50℃4.PBS洗3×3min5.10％醋酸20min室温，阻断内源性碱性磷酸酶6.PBS洗3×3min第13页/共24页第十三页，共25页。信号放大和显示1.1:500稀释AKP标记抗Dig二抗，37℃4h，或4℃过夜2.PBS洗3×3min3.TSM1洗2×5min4.TSM2洗2×5min5.显色液在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l，BCIP

混合后，显色30min～12h，中间不断观察6.TSM2洗，PBS洗3×3min，核固红或甲基绿衬染7.蒸镏水洗，系列乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片第14页/共24页第十四页，共25页。结果判断

第15页/共24页第十五页，共25页。ISH流程探针合成组织细胞标本的准备ISH试剂的配制操作流程第16页/共24页第十六页，共25页。探针1、根据文献报道合成PCR引物一对。

2、PCR扩增：用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。第17页/共24页第十七页，共25页。3、将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒（EcoRI和ACCI酶切位点），在大肠杆菌中扩增，纯化。原理：PGEM3质粒购于promega公司，含有位于pUc19MCS侧面的SP6和T7RNA聚合酶启动子，在将所需序列插入MCS后，一个简单的基于lacZα-肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选。在体外，将SP6或T7RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针。第18页/共24页第十八页，共25页。4、

利用Roche生产的体外转录标记RNAkit（Cat.No999644）操作流程参阅《原位检测技术》p132-133。第19页/共24页第十九页，共25页。

组织细胞标本的准备

ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理）第20页/共24页第二十页，共25页。操作流程11、活细胞经4％多聚甲醛固定20min，室温，PBS