酪氨酸酶的粗提取,分离纯化、纯度鉴定及活性测定

西安交通大学实验报告西安交通大学实验报告课程： 专业班级：组别姓名：学号同组者：成绩实验日期：2012年月日交报告日期：2102年月日报告退发：（订正、重做）教师审批签字：实验名称：酪氨酸酶的粗提取、分离纯化、纯度鉴定及活性测定实验目的：自行查阅资料，选取原材料，设计合理的酪氨酸酶提取、分离、纯化鉴定以及活性测定的方案；按照实验方案，自主进行实验并对实验方案进行评价和改进；通过酪氨酸酶的分离过程，了解并熟悉生物工程下游分离工程的一些常规操作；对实验结果进行总结，分析和汇总展示，培养分析问题和自我展示的能力。实验原理：酪氨酸酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物和微生物体内。与生物体黑色素的合成直接相关。近年来，有学者已经从各种植物中提取得到酪氨酸酶，如马铃薯，蘑菇，香蕉，苹果，桑叶以及香樟等。相关资料显示，L-多巴和邻苯二酚测定体系都说明香蕉，马铃薯及蘑菇中酪氨酸酶的活性较高。因此，本实验选取香蕉为实验原材料，通过简单的提取分离以及纯化，初步得到了酪氨酸酶的样品（溶液），并用邻苯二酚为底物对其活性做了定性鉴定。酪氨酸酶的粗提取包括研磨（匀浆），过滤，离心，盐析和透析等过程。盐析蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。随着溶液中离子强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。同时由于盐的水化作用使蛋白质表面的疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出来，增大了蛋白质表面的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。盐析的方法有Ks盐析法

和B盐析法，前者是改变体系的离子强度，而后者的则通过改变温度和pH实现。由于蛋白质对离子强度的变化十分敏感，所以常采用Ks盐析法。常用的盐有硫酸铵等。通过查阅资料，本实验中采用饱和度为55%的硫酸铵进行酪氨酸酶的盐析沉淀。透析是一种膜分离的方法，利用的是浓度引起的自由扩散，在透析袋内盛放盐析后酪氨酸酶的溶解液，放入缓冲液内透析，目的是除去盐析过程带入的离子。透析袋在使用前一般需要进行预处理。通过以上操作可得到酪氨酸酶的粗酶液。粗酶液需要进一步的分离纯化。离子交换色谱法是一种利用离子交换剂作为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。离子交换色谱法洗脱的方式有恒定洗脱，线性梯度洗脱和逐次洗脱的方式。使用离子交换色谱时，首先需要填充固定相，如果是干粉还需要溶胀，填充的色谱柱不能有气泡，否则会影响分离结果。上样前需要先用上样缓冲液平衡，上样后需要用有一定离子强度的洗脱液洗脱，获得蛋白质样品。经离子交换色谱柱纯化后的样品还可以继续纯化。由于实验条件和时间的限制，本实验的纯化仅进行到离子交换色谱一级。对于纯化后的样品，首先需要对其纯度进行鉴定，纯度鉴定采用SDS（聚丙烯酰胺凝胶电泳）来验证。由于邻苯二酚在酶和氧的条件下转变成邻苯醍的速率很快，故可测定邻苯二酚转变成邻苯醍的速率而测定酶的活性（可用411nm处的吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性）。实验设计的思路可以用如下流程图表示：研厝"过滤离心研厝"过滤离心平衡上样洗脱酪氨酸酶

的粗提取离子交换色

谱分离纯化凝胶色谱

施化盐析透析SDS电泳酪氨酸醇活

牲的测定酪氨酸酶纯

度的签定酪氨酸酶

的粗提取离子交换色

谱分离纯化凝胶色谱

施化盐析透析SDS电泳酪氨酸醇活

牲的测定酪氨酸酶纯

度的签定实验器材及材料：冰箱，天平，匀浆器，纱布，烧杯100ml,250ml,500ml各1个）,试管20个，5810R离心机，精密pH试纸，透析袋（截留分子量8000-14000，宽20mm），镊子，电泳槽，梳子，电泳仪，小型摇床，大培养皿，电炉，手套，口罩，50ml离心管，涡旋仪，1.5mlep管，量筒（10ml，100ml，500ml各一个），滤纸，移液枪（10|il，200|il，1000|il），枪头（1000|ll，200|il，10|il），阴离子交换柱，离子交换色谱仪，Ultrospec2100pro紫外可见分光光度计，石英比色皿；实验原材料：香蕉2.5kg；pH7.5Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L）；硫酸铵（需要配成饱和溶液）；lmmoI/LEDTA-Na2,2%碳酸氢钠；0.02mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5）；30%凝胶储液，1.5mol/LTris-HCL（pH8.8），1mol/LTris-HCL（pH6.8），10%SDS，10%AP，TEMED，蒸馏水，2X样品溶解液，5X电泳缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，低分子蛋白marker，凡士林，邻苯二酚，L-DOPA，pH7.2的磷酸盐缓冲液：Na2HPO4，NaH2PO4。实验内容及步骤：（一）酪氨酸酶的粗提取将预先冷藏过的香蕉去皮，准确称量50g，加入50ml0.1mol/LTris-HCl（pH7.5）缓冲液，多次间歇性匀浆。匀浆后，倒出香蕉混合物，双层纱布过滤，用0.1mol/LTris-HCl缓冲液冲洗纱布，收集滤液，弃残渣物质。将滤液分装至50ml离心管内，4r,4000r/min，离心10min，收集上清，弃沉淀和漂浮物。上清液分装至50ml离心管内，再次4r,4000r/min，离心10min，弃沉淀和漂浮物，收集上清液。在收集到的上清液内加入饱和度为55%的硫酸铵，盐析沉淀3h。用50ml离心管分装，4r,4000r/min，离心10min，弃上清。每管内各加入1000m0.02mol/L的Tris-HCI缓冲液（pH7.50），用移液枪枪头慢慢吹打,使沉淀物充分溶解。取约10cm长的透析袋，浸没于lmmoI/LEDTA溶液内，煮沸3min，用镊子取出，浸入2%碳酸氢钠溶液中煮沸3min，再用镊子取出，浸入蒸馏水中，煮沸3min，漂洗干净。将处理过的透析袋的一端密封，加入上述各离心管内的沉淀物溶解液，将另一端也密封后，置于0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液内，使透析袋没过液面。4c,透析48h，期间共换0.02mol/LTris-HCL缓冲液3次。透析除盐后，即得粗酶液。在进行下一步分离纯化之前，需要进行酶活性的定性鉴定。酶活性定性鉴定采用邻苯二酚反应体系进行，即在一定物质的量浓度的邻苯二酚溶液内加入少许粗酶液，振荡片刻，同空白对照对比，看有无显色。酪氨酸酶的分离纯化(离子交换色谱)由于实验前毕业生学长已经装好阴离子交换柱，所以实验操作过程省去了装柱的环节。启动计算机，打开软件PrimeView，开启离子交换色谱仪。选择手动模式(manual)。A、B进液管均插入蒸馏水内，设置A和B以1：1流入，流速4ml/min。待基线走平后，将A管插入0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液，B管插入含有0.5mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.5)，先设置B管流入，A管不流入，待盐度曲线走平后，设置A管流入，B管不流入。待盐度曲线下降并走平后，在load状态下上样，每次注入5ml，然后设置状态为inj。期间流速一直保持4ml/min。上样后在0.02molTris-HCl作用下，部分杂质被洗下，在图线上会出现吸收峰。待吸收曲线走平后，设置B管流入，A管不流入，用含0.5molNaCl的Tris-HCl进行洗脱。随着盐度曲线的上升，蛋白质吸收曲线也开始上升并出现吸收峰。对吸收峰以及附近的洗脱液进行分管收集，按每管3ml进行收集。对收集到的样品液进行酶活性的筛选，获得有酶活性的试管。混合pH6.0磷酸缓冲液1.4ml及0.1mol/L邻苯二酚溶液1.0ml，再加入0.1ml各管收集到的酶液，记录开始变色时间，将各管反应半个小时以上，测最终吸光度值并记录。离子交换色谱柱在使用过程中，要及时排尽进液管A和B中的气泡，否则会影响分离效果。酪氨酸酶纯度的鉴定(SDS电泳)部分试剂的配制(称量配制过程中要戴口罩，戴手套)：30%丙烯酰胺：称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加热溶解于去离子水，定容至100ml，放入棕色试剂瓶内，4C保存避光。1mol/LTris-HCl(pH6.8):称取Tris12.11g，充分溶解于70ml去离子水，用稀HCl调节pH至6.8，定容至100ml，室温保存。1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）:称取Tris18.17g,充分溶解于70ml去离子水，用稀HCl调节pH至8.8，定容至100ml，室温保存。10%SDS：称取1.0gSDS，溶解于去离子水，定容至10ml，室温保存。10%过硫酸铵（AP）:称取过硫酸铵1.0g，溶解于去离子水，定容至10ml，分装于Ep管中，-20°C冷冻保存。2x样品溶解缓冲液:依次取12.5ml1mol/LTris-HCl（pH6.8），10ml甘油，2gSDS，1ml0-巯基乙醇，1mg漠酚蓝，混合，用去离子水定容至50ml，分装于Ep管中，-20C冷冻保存。5x电泳缓冲液：称取Tris7.55g，甘氨酸36g，SDS2.5g，用ddH2O定容至500ml，室温保存。考马斯亮蓝染液（R-250）:称取0.5考马斯亮蓝R-250，先溶于60ml乙醇，再加入20ml乙酸，用ddH2O定容至200ml，室温保存。脱色液：取60ml乙醇，20ml乙酸，混合后用ddH2O定容至200ml，室温保存。组装制胶装置，安装玻璃胶板（配制较低的电泳槽需要涂抹凡士林密封胶室），固定于电泳槽，插梳子，在梳子下缘约1cm处做标记线，取下梳子。各试剂按照下列表格用量，先配制12%分离胶，10%AP与TEMED最后加入。加入TEMED后，迅速涡旋，用1000叫枪头迅速灌入胶室内，至标记线处。加入约0.5cm厚的水层。等待分离胶凝固。试剂12%分离胶（ml）5%浓缩胶（ml）20ml体系5ml体系ddH2O6.63.430%聚丙烯酰胺8.00.831.5MTirs-HCl(pH8.8)5.0/1.0MTirs-HCl(pH6.8)/0.6310%SDS0.40.0510%AP0.40.05TEMED0.0080.0054.分离胶凝固后，倒去上层水，在分离胶面上加浓缩胶，充满胶室，插入梳子。浓缩胶凝固后，在电泳槽上下两端注满1x电泳缓冲液（上槽加5x电泳缓冲液可加快电泳速度，节省电泳时间），然后小心缓慢取下梳子，用枪头小心拨去胶板上缘多余的胶，小心调整弯曲的胶孔。处理样品：用移液枪吸取各个酪氨酸酶样10叫于小ep管内，加入10叫2x样品溶解缓冲液，混匀后沸水浴5min，低分子蛋白marker不沸水浴，不加2x样品溶解缓冲液，用10B移液枪小心将各个样品加入上样孔内。连接导线，80V电压电泳，待样品进入分离胶后，上调电压使电流不超过40mA为宜，当指示剂到达距胶下缘时，停止电泳。用撬胶板小心撬开玻璃板，沿分离胶与浓缩胶界面，以及两侧与玻璃板的边界切下，在胶面面对上样的方向的右下角切下小角，保证识别方向。考马斯亮蓝染液加入大培养皿。置于小型摇床上，调整转速，染色过夜。回收染色液，将染色后的胶片置于加入脱色液的大培养皿内，置于摇床上，洗掉多余的染液，没3h换一次脱色液，待胶片上多余的染液洗脱干净后，将胶片取出，观察电泳条带。（四）酪氨酸酶活性的鉴定在石英比色皿内加入pH6.0磷酸缓冲液1.4ml及0.2mol/L邻苯二酚溶液1.0ml，混匀。将石英比色皿放入Ultrospec2100pro紫外可见分光光度计内，迅速加入0.1ml所得酪氨酸酶液，在411nm处，每隔一分钟测定一次，绘出吸光度对时间的变化曲线。从曲线斜率求酶的活性。实验结果及分析：（一）粗酶液活性的定性测定结果在一定物质的量浓度的邻苯二酚溶液内加入少许粗酶液，振荡片刻，同空白对照对比，呈现深黄色，颜色变化明显，说明粗酶液有活性，可以使用离子交换色谱法分离纯化。图1.粗酶液有活性

（二）酪氨酸酶的分离纯化结果离子交换色谱分离过程中，蛋白质紫外吸收吸收曲线如图2所示，可以看出，杂蛋白吸收峰很低，说明杂蛋白含量很低。而酪氨酸酶吸收峰也不是十分可观，说明所得酪氨酸酶浓度偏低。n ijvrTiAucond p-i PressureTe140120-^.1il-T"I:FSO-:::100n ijvrTiAucond p-i PressureTe140120-^.1il-T"I:FSO-:::10060-一尊一员一苗墨El-B-r—L离戋-?9-08ZM营T一：*!■■.“..•砖一Hg巨展..:务-J'llLA•.■..:*•-J'llLsmg-•.■..一：l::=・;..L悟里二&s§、E_”』•，.： UEE^1479ir-iinFlow40iril/miriminPeuwQ。孙00&二"P中I51中国标推时间（MesI]44SflminFlowCl0ml.i'min4484minMongol5etCcncemlrcrtlDnEd:汨_4萼4mmConijnije2000-6-7..17:-45:05中国标？时间（MonuBd]4司8。ininFlow40iril/miri MNaw«kd-i [UtankHadN：ptiri.449BminPbuw0Xi20CO^7.V^51? MNaw«kd-i [UtankHadN：ptiri.ForHdp,pibibrI. 4P->.l>=-Ham图2.离子交换色谱蛋白质紫外吸收吸收曲线（图中蓝线）按照吸收峰，初步判断13-25号管内含有酪氨酸酶，将其分装并冷冻保存。混合pH6.0磷酸缓冲液1.4ml及0.1mol/L邻苯二酚溶液1.0ml，再加入0.1ml各管收集到的酶液，记录开始变色时间，将各管反应半个小时以上，测最终吸光度值并记录如表一。按照开始变色时间及最终吸光度的值，可以判断13、14、21-25号管基本无酶活性。17号管内的酶活性最强，18、19号管次之。管号151617181920开始变色时间/min553344.5吸光光度值（411nm）0.2260.2780.4230.3230.3280.180表一.以邻苯二酚为底物反应筛选有酶活性的试管

通过多次SDS电泳，没有得到蛋白质电泳条带（隐隐约约，依稀可见。分析原因可能为所的样品中酪氨酸酶虽然活性较高，但浓度较低所致。三次蛋白电泳条带结果如图4。由于每次SDS同其他一起进行并共用胶片，操作条件一致，所以排除操作因素引起的误差。图4.三次蛋白电泳条带图（图中空白皆为我组结果）（四）酪氨酸酶活性的鉴定结果根据实验所得吸光度随时间的变化曲线可知，17号管，即经过纯化的酶液的活性较高，且高于粗酶液。其中，17号管吸光度随时间变化曲线斜率为0.033,粗酶液为0.02。时间/min0.51.52.53.54.55.56.57.58.59.510.517号管od4110.2830.3910.4750.5390.5850.6170.6370.6490.6540.6530.648粗酶液od4110.2300.4990.6300.6930.7150.7130.6960.6700.6410.6090.580表二.酪氨酸酶活性鉴定数据记录

图5.粗酶液和邻苯二酚反应体系吸光度值随时间的变化曲线图6.17号管酪氨酸酶和邻苯二酚反应体系吸光度随时间变化曲线（五）实验思考和改进盐析的过程仅仅以文献查得数据进行，设计过于简单，致使实验粗糙，提取得到的酪氨酸酶酶浓度过低，应该在实验中设对照实验，选取最佳盐浓度，并采用分级沉淀，达到更好的盐析效果。由