血细胞染色课程学习

瑞士染色第1页/共136页第一页，共137页。POX染色第2页/共136页第二页，共137页。目的要求：1了解各类血细胞化学反应的原理。

2掌握细胞化学染色结果的判断及临床意义概念细胞化学染色——是以形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内各种化学物质、代谢成份（如酶类、酯类、糖类、铁、蛋白质核酸等）作定性、定位、半定量的分析方法。第3页/共136页第三页，共137页。目的：①辅助判断急性白血病细胞类型eg：POX酯酶②辅助血液系统疾的诊断和鉴别诊断eg：NAP③观察疾病疗效和预后④探讨发病机制第4页/共136页第四页，共137页。基本操作

固定——保持细胞结构及化学成份不变。

1物理法：①干燥②火焰

2化学法：甲醛、乙醇、甲醇、丙酮显示——通过化学反应形成稳定的有色沉淀常有的化学反应：

1偶氮偶联法酯酶染色

2联苯胺法POX3普鲁士兰反应铁染色

4雪夫反应PAS5金属沉淀法NAP

复染——使细胞显示出来，颜色要与有色沉淀有明显对比度第5页/共136页第五页，共137页。常用血细胞化学染色1、过氧化酶染色（POX）2、非特异性酯酶染色（NAE）3、糖原染色（PAS）4、中性粒硷性磷酸酶染色（NAP）5、铁染色“第6页/共136页第六页，共137页。过氧化物酶染色（POX）

(peroxidase-stain)

第7页/共136页第七页，共137页。POX的性质:酶类,结合蛋白POX的存在：生物体内

线粒体和溶酶体中,中性粒细胞含量最多.POX的功能：破坏氧化过程有剧毒的过氧化物。原理：细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解，产生新生态氧，后者使试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝（不稳定的中间产物质位于酶所在位置，于空气中可变为蓝黑色）

H2O2→H2O+（O）↑无色联苯胺（O）（蓝色）联苯胺蓝→二苯醌二胺（蓝黑色）不稳定中间产物（在空气中）第8页/共136页第八页，共137页。第9页/共136页第九页，共137页。结果判断：阴性：无颗粒弱阳性：细小颗粒，分布稀疏，少阳性：颗粒粗，分布密集强阳性：颗粒粗大，充满胞质第10页/共136页第十页，共137页。第11页/共136页第十一页，共137页。第12页/共136页第十二页，共137页。第13页/共136页第十三页，共137页。各类血细胞的染色反应1粒系：分化差的原始粒：阴性分化好的原始粒→中性成熟粒细胞阳性嗜酸粒细胞:阳性颗粒粗大嗜碱粒细胞:阴性2单核细胞系：原始单—阴性幼单、成熟单—弱阳性（大部分）3红系、淋巴、巨核细胞、浆细胞、组织细胞:阴性4组织细胞:阴性吞噬网状细胞有时为阳性5遗传性POX缺乏症：阴性第14页/共136页第十四页，共137页。第15页/共136页第十五页，共137页。第16页/共136页第十六页，共137页。临床意义

1鉴别急性白血病（粒、淋、单）

2区别小原粒与原始淋

3急性早幼粒白血病与急性单核细胞白血病

4急单与组白及恶组病的鉴别成熟中性粒细胞POX活性变化↑：再障、感染（化脓性细菌性感染）、急淋、慢淋↓：急粒、慢粒、急单、MDS、放射病、退化的中性粒第17页/共136页第十七页，共137页。第18页/共136页第十八页，共137页。瑞士染色第19页/共136页第十九页，共137页。POX染色第20页/共136页第二十页，共137页。注意事项过氧化氢要保证质量，乙液要新鲜配制，浓度一定要控制，否则反而抑制酶（0.05mol/L）在甲液上加乙液后要马上混匀，否则染色情况不一致加过氧化氢低倍镜下出现阳性颗粒，马上就冲，否则弱阳性不好看。第21页/共136页第二十一页，共137页。苏丹黑B染色

(sudanblackB–stain)第22页/共136页第二十二页，共137页。苏丹黑B（SBB）是一种脂溶性重氮染料，能溶解细胞内含酯结构，使酯类物质显示出来。SBB与POX比较：

POX特异性高，临床首选

SBB敏感性高第23页/共136页第二十三页，共137页。酯酶染色法

(esterase-stain)第24页/共136页第二十四页，共137页。第25页/共136页第二十五页，共137页。酯酶性质：水解酶

酯酶存在：人和啮齿类动物血细胞内含有多种酯酶及同工酶分类：特异性酯酶染色：氯乙酸AS-D萘酚酯酶（AS-DNCE）非异性酯酶染色：

1中性：α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）（敏感性高）醋酸AS-D萘酚酶（AS-D）

2酸性：酸性α-醋酸萘酚酯酶（ANAE）鉴定T、B淋巴细胞

3碱性：α-丁酸萘酚酯酶染色（α-NBE）：（特异性高）-单核-巨噬细胞的标志酶第26页/共136页第二十六页，共137页。第27页/共136页第二十七页，共137页。第28页/共136页第二十八页，共137页。中性非特异性酯酶染色（α-NAE）（α-醋酸萘酚酯酶）（-）原理：酯酶（α-NAE）在PH中性条件下,将基质液中α-醋酸萘酚水解产生α-萘酚，α-萘酚与重氮盐（坚牢兰）偶联，生成不溶的有色沉淀（灰黑色）,定位在酶所在的部位.加氟化钠抑制试验→抑制、不被抑制

α-NAE存在于单核细胞粒细胞及淋巴细胞中,故为中性非特异性酯酶染色;单核细胞的阳性可被氟化钠抑制故做α-NAC染色时,同时做氟化钠抑制试验第29页/共136页第二十九页，共137页。第30页/共136页第三十页，共137页。结果：阳性：胞浆内有灰黑色或棕黑色弥漫性颗粒状沉淀阴性：无色第31页/共136页第三十一页，共137页。第32页/共136页第三十二页，共137页。第33页/共136页第三十三页，共137页。第34页/共136页第三十四页，共137页。正常血细胞α-NAE染色反应1单核系：分化差的原单（-）分化好的原单（+）+NaF抑制幼稚单——成熟单（+）+NaF抑制2粒系：各期粒细胞（-）少数（±）+NaF不被抑制3淋巴系：各期淋巴（-）少数（±）+NaF不被抑制4红系：各期幼红细胞（-）少数（±）+NaF不被抑制5其他：巨核细胞、血小板（+）+NaF不被抑制第35页/共136页第三十五页，共137页。第36页/共136页第三十六页，共137页。第37页/共136页第三十七页，共137页。α-NAEα-NAE++NaF抑制第38页/共136页第三十八页，共137页。临床意义：

辅助鉴别急性白血病

急单急粒急性早幼粒急淋红白或红血病

+（-）或（±）+（-）或（±）+（幼红细胞）+NaF抑制不抑制不被抑制不被抑制不被抑制第39页/共136页第三十九页，共137页。第40页/共136页第四十页，共137页。特异性酯酶染色

（氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色）

(naphtholAS-Dchloroacetateesterase)第41页/共136页第四十一页，共137页。特异性酯酶染色（氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色）特点：特异性高，只出现在粒细胞中（以称粒细胞酯酶）原理：血细胞内AS-D萘酚酯酶水解基质液中氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液重氮盐（坚牢兰）偶联，生成不溶的有色沉淀（灰黑色）,定位在酶所在的部位.意义：辅助鉴别急性白血病类型第42页/共136页第四十二页，共137页。正常血细胞染色反应：

1粒系：分化差原始粒（-）分化好原始粒（+）早幼→成熟中性粒（+）（早幼、中幼阳性最强）嗜酸、嗜碱（-）或（±）

2单核（-）个别（±）

3肥大细胞：（+）

4自然杀伤细胞（NK）阳性率约50%5其他细胞：淋巴、浆细胞、巨核细胞、幼红细胞、血小板（-）第43页/共136页第四十三页，共137页。意义：辅助鉴别急性白血病类型1.急粒（+）M3强（+）急单（-）M7（-）2.急粒-单白血病原.早幼粒（+）原.幼单（-）3..急淋（-）NK白血病50%（+）第44页/共136页第四十四页，共137页。第45页/共136页第四十五页，共137页。第46页/共136页第四十六页，共137页。糖原（PAS）染色

(periodicacid-Schiffreaction)

第47页/共136页第四十七页，共137页。第48页/共136页第四十八页，共137页。第49页/共136页第四十九页，共137页。糖原染色原理：糖原染色又称为过碘酸-雪夫染色过碘酸是氧化剂，能氧化多糖物质（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖脂等）中的乙二醇基[-（HOH-CHOH）]，形成醛基[-CHO-CHO]，醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使无色的亚硫酸品红（失去亚硫酸重新排列，恢复品红的对醌结构）变成紫红色物质，定位于多糖类的细胞内。第50页/共136页第五十页，共137页。第51页/共136页第五十一页，共137页。第52页/共136页第五十二页，共137页。第53页/共136页第五十三页，共137页。第54页/共136页第五十四页，共137页。PAS染色形态状描述：颗粒状，小块状（包涵体状），弥漫均匀红色。

PAS阳性程度判断：阴性：无颗粒弱阳性：细颗粒阳性：粗颗粒强阳性：大、小块状第55页/共136页第五十五页，共137页。正常血细胞PAS染色反应正常血细胞PAS染色反应粒系：分化差的原始粒（-）分化好的原始粒——中性分叶核+逐渐增强嗜酸：颗粒不着色，颗粒间呈红色嗜碱：颗粒（+）颗粒间不着色红系：（-）单核细胞系统：分化差的原单（-）分化好的原单——成熟单：细胞颗粒（+）弥散分布（边缘可见粗大颗粒）淋巴细胞系统：大多数（-）＜20%（+）（粗颗粒及块状）巨核细胞系统：（+）血小板（+）其他：浆细胞（-）或细颗粒（+）巨噬细胞：细颗粒（+）第56页/共136页第五十六页，共137页。第57页/共136页第五十七页，共137页。临床意义：1红血病、红白血病、MDS（+）（块状或均匀红色）2辅助鉴别白血病急淋急粒急单（+）（+）或（±）（+）

粗颗粒或块状均匀淡红色或细颗粒状细颗粒弥散分布巨核细胞白血病（M7）嗜碱性粒细胞白血病慢淋（+）（+）（+）粗颗粒或小珠、块状3其他：戈谢(Guqcher)尼曼-匹克(Nieman-Pick)

强（+）弱（+）或（-）

Reed-sternberg腺癌组织嗜碱细胞（-）或（±）（+）（+）第58页/共136页第五十八页，共137页。第59页/共136页第五十九页，共137页。第60页/共136页第六十页，共137页。第61页/共136页第六十一页，共137页。第62页/共136页第六十二页，共137页。第63页/共136页第六十三页，共137页。尼曼-匹克(Nieman-Pick)

瑞士染色PAS染色第64页/共136页第六十四页，共137页。碱性磷酸酶（NAP）染色

(neutrophilicalkalinephosphatase-stain)第65页/共136页第六十五页，共137页。存在:成熟中性粒细胞内,主要见于分叶核及杆状核.根据其酶染色强弱而来协助诊断及鉴别于其它疾病。第66页/共136页第六十六页，共137页。NAP染色方法

Comori钙-钴法：

Kaplow偶氮偶联法试剂盒Kaplow偶氮偶联法原理：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在PH9.4～9.6碱性环境中，水解基质液α-磷酸萘酚钠底物，释放出α-萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性灰黑色沉淀，定位在胞质酶活性所在之处。NAP正常值：阳性率：10%～40%积分：40～80分（各单位应建立本实验参考值）第67页/共136页第六十七页，共137页。碱性磷酸酶（NAP）染色钙-钴法原理

中性粒细胞中有碱性磷酸酶存在时，可分解β-甘油磷酸钠，为磷酸钠和甘油。磷酸钠再与硝酸钙、硝酸钴、硫化铵起一系列的化学反应，最后生成黑色的硫化钴，沉淀于细胞浆中，用来测定中性粒细胞中NAP活性第68页/共136页第六十八页，共137页。第69页/共136页第六十九页，共137页。第70页/共136页第七十页，共137页。结果：1阳性反应：胞浆中出现灰色或棕黑色沉淀。2阳性反应分级标准。（—）无色（+）胞浆浅灰色，均匀无颗粒或仅少部分胞浆有灰黑色沉淀（++）胞浆灰黑色或出现稍致密棕黑色片状沉淀（+++）胞浆充满棕黑色片状沉淀，但分布均匀，密度较低，较密，团块较少（++++）全部胞浆深黑色，并充满致密团块沉淀，甚致黑色沉淀可遮盖胞核第71页/共136页第七十一页，共137页。NAP阳性强度判断第72页/共136页第七十二页，共137页。第73页/共136页第七十三页，共137页。积分法观察100个成熟中性粒细胞（分叶、杆状），按其反应强度求其百分率，各级百分率与其级数乘积的总和即为积分。eg：“0”10%“+”20%“++”40%“+++”20%“++++”10%阳性率=20+40+20+10=90%积分=（1×20）+（2×40）+（3×20）+（4×1）=200正常值

NAP阳性率：10～30%积分：＜50成熟中性粒细胞（分叶、杆状)呈阳性反应，其他细胞基本呈阴性第74页/共136页第七十四页，共137页。临床意义：NAP生理变化1年龄“新生儿↑儿童＞成人＞老人(活性)2应急：紧张、恐惧、激烈运动：↑3月经：经前：↑经后：↓经后期恢复4妊娠：2～3月：↑（轻度）分娩：高峰产后：正常第75页/共136页第七十五页，共137页。NAP病理变化1NAP积分↑：细菌感染、AA、某些骨髓增殖性疾病，如慢中粒白血病、骨纤、真红、原发性血小板增多症、慢粒（加速期、急变期）、急淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、肾上腺糖皮质激素及雄性激素治疗后NAP积分↓：慢粒（慢性期）、急粒、MDS、恶组、PNH、

ITP、传单、粒缺、病毒感染第76页/共136页第七十六页，共137页。NAP疾病鉴别↓↑

PNHAA

病毒感染细菌感染慢粒类白反应慢粒慢中粒恶组淋巴瘤恶组反应性组织细胞增多症急粒急淋继发性红细胞增多（无变化）真红继发性血小板增多症（无变化）原发性血小板增多症第77页/共136页第七十七页，共137页。第78页/共136页第七十八页，共137页。第79页/共136页第七十九页，共137页。第80页/共136页第八十页，共137页。重点、难点：基质液的配制、结果判定、临床意义。注意事项：1基质液要新鲜配制2基质液PH一般为9.4～9.6PH＜9酶活性下降，

PH＞10细胞易破碎。3涂片应新鲜，一周内固定，染色。4每次染色要有阳性对照。第81页/共136页第八十一页，共137页。

酸性磷酸酶ACP

(acidphosphataseACP)

和抗酒石酸酸性磷酸酶染色

(tartyate-resistantphosphataseTRAP)第82页/共136页第八十二页，共137页。

酸性磷酸酶ACP与细胞的许多生理功能和病理变化有关，血细胞的ACP有7种同工酶（ACP0、1、2、3、3b、4、5），某些血液病与ACP同工酶出现有关。ACP0存在于Gaucher细胞.单核细胞和巨噬细胞；ACP3存在于淋巴细胞；ACP3b存在于各型AL的原始细胞；ACP5存在毛细胞。ACP1、2、4存在于中性粒细胞ACP染色方法：硫化铅法偶氮偶联法第83页/共136页第八十三页，共137页。硫化铅法原理：血细胞内ACP酸性条件下（PH5.0），可分解β-甘油磷酸钠，产生磷酸根。磷酸根再与硝酸铅作用生成磷酸铅、沉淀于细胞浆中磷酸铅与硫化铵反应，最后生成黑色的硫化铅沉淀。第84页/共136页第八十四页，共137页。抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）

抗酒石酸酸性磷酸酶染色，用相同方法制备两份基质液，一份加L-酒石酸，一份不加L-酒石酸，取两张同标本涂片，分别用两种不同基质液做ACP染色。如果血细胞内ACP耐酒石酸，两张均阳性，如不耐酒石酸，则不加酒石酸者阳性，加酒石酸者阴性。第85页/共136页第八十五页，共137页。第86页/共136页第八十六页，共137页。第87页/共136页第八十七页，共137页。铁染色(ferric-stain)正常骨髓中有一定量的铁，以铁蛋白和含铁血黄素形式储存，用以合成血红蛋白，这种储存的铁称细胞外铁。幼红细胞内含有铁颗粒（铁蛋白）存在于胞质中，这类红细胞称铁粒幼红细胞。铁染色的目的是了解体内铁的贮存及利用情况。第88页/共136页第八十八页，共137页。第89页/共136页第八十九页，共137页。第90页/共136页第九十页，共137页。铁染色化学反应原理骨髓粒中的含铁血黄素（细胞外铁）和幼红细胞中的铁粒（细胞内铁）其中三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后，而游离，与酸性低铁氰化钾起反应，形成普鲁士兰色的亚铁氰化铁.根据反应的强弱，了解骨髓中铁的含量。

第91页/共136页第九十一页，共137页。第92页/共136页第九十二页，共137页。第93页/共136页第九十三页，共137页。

结果：1细胞外铁检查：将铁染色的骨髓片先用低倍镜观察，再用油镜检查片中未尽展开的骨髓碎粒，铁颗粒呈浅蓝色、深兰色，共分五等。（-）无铁颗粒可见。“+”有少数铁颗粒或仅偶见少数铁小珠。“++”有较多的铁颗粒和小珠。“+++”有很多铁颗粒小珠和少数小块。“++++”有极多铁颗粒小珠，并有很多小块。正常值：2/3的人为“++”1/3的人为“+”第94页/共136页第九十四页，共137页。细胞外铁++++++++++第95页/共136页第九十五页，共137页。第96页/共136页第九十六页，共137页。第97页/共136页第九十七页，共137页。2细胞内铁检查：幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁颗粒呈兰绿色。计数100个幼红细胞，并记录含铁颗粒的阳性和阴性比例，算出百分率，并根据细胞内铁颗粒的数目、大小，染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型。

I型：含铁1～2粒

II型：3～5粒

III型：6～9粒

III型：含10粒以上铁颗粒正常值：细胞内铁：19%～44%以I型为主少数为II型（无环形铁及铁粒红细胞）第98页/共136页第九十八页，共137页。第99页/共136页第九十九页，共137页。第100页/共136页第一百页，共137页。

环形铁粒幼红细胞的标准：粒幼红细胞含有粗大深染的铁颗粒含10粒以上，其中2/3以上的铁粒绕核形成完全或不完全性环形（围核1/2以上的区域有铁粒环绕）铁粒幼红细胞:幼红细胞内出现铁颗粒铁粒红细胞:成熟红细胞内出现铁颗粒环形铁粒幼红细胞:幼红细胞内出现环形铁第101页/共136页第一百零一页，共137页。第102页/共136页第一百零二页，共137页。第103页/共136页第一百零三页，共137页。第104页/共136页第一百零四页，共137页。第105页/共136页第一百零五页，共137页。第106页/共136页第一百零六页，共137页。第107页/共136页第一百零七页，共137页。第108页/共136页第一百零八页，共137页。铁染色临床意义：

1诊断缺铁性贫血，指导铁剂治疗。

2诊断铁粒幼细胞性贫血

3MDS-RAS环形铁＞15%4非缺铁性贫血内外铁正常或↑：溶贫、巨幼贫、AA、多次输血后，白血病外铁↑内铁↓：感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病第109页/共136页第一百零九页，共137页。重点、难点结果和临床意义注意事项：1玻片要干净，去铁处理。2酸性亚铁氰化钾要新鲜配制，要澄清，浑浊要用亚铁氰化钾液滴致清亮。3选用有骨髓小粒的片子染色。