DB15-T 2835-2022 马驽巴贝斯虫检测 PCR法

～10

。～10

。

PCR

1 范围本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光检测方法。本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。2 规范性引用文件文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T

27403 实验室质量控制规范

食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。马驽巴贝斯虫

caballi内的血液原虫。聚合酶链式反应

chain

reaction；用于扩增位于已知序列之间DNA（deoxyribonucleic

acid，脱氧核糖核酸）的方法。模板DNA经过DNADNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（deoxyribo

nucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这6实时荧光 PCR

real-time

PCR在PCR反应体系中加入荧光基团,

利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct

值cycle

thresholdDB15/T

2835—2022每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:

碱基对(base

pair)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyl

trithyl

ammonium

bromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic

acid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene

acid)FAM:6-羧基荧光素PCR:聚合酶链式反应（

chain

reaction）TAMRA:

羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]5 试剂与材料水：符合

GB/T

6682

的要求。DNA

提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl

8.0)。NaCl。EDTA。蛋白酶

K

溶液

。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。Taq

dNTP（2.5

mmol/LPCR

buffer。DNA

分子量标准（

50

bp～500

bp实时荧光

预混液。阳性对照样品：采用已知含有马驽巴贝斯虫的

DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录

B。阴性对照样品：采用已知不含有马驽巴贝斯虫的

。空白对照：ddH2O。引物及探针:

1。-3PCR-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3200bp-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3PCR-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3200bp-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG--3DB15/T

2835—2022表1马驽巴贝斯虫检测引物及探针6 仪器与设备PCR

凝胶成像仪。实时荧光

高速台式离心机（最高转速

12000

旋涡振荡器（最高转速

rpm）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平（感量

0.01

g）。单孔道微量移液器：0.5

L～10

L、10

L～

L、20

L～

L、

L～1000

L。7样品采集使用添加EDTA抗凝剂的采样管无菌采集血样。8 检测方法PCR

法8.1.1样品的总

参照附录A中提取样品DNA的方法提取，也可采用等效商品化的血液提取试剂盒进行。当浓度吸光度值A260/A280在～1.9PCR及空白提取对照。8.1.2PCR

反应体系为50

L，体系组成见表2。10

0.25dNTP2.5

10

10

ddH2

50DB15/T

2835—2022表2PCR

扩增反应体系组成检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。8.1.3PCR

反应条件预变性：95

℃，3

min；变性：

95

30

s；延伸退火：58

℃，1

min，个循环；

℃延伸5

min；4

℃保存。8.1.4PCR

扩增产物电泳检测用TBE电泳缓冲液配制成琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5

L～8

L

扩增产物分别和适量加样缓冲液混合点样。9

V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。8.1.5 结果判定与表述8.1.5.1 质量控制质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)

阳性对照:

200

bp

的特异性条带；b)

阴性对照：不出现

的特异性条带；c)

空白对照：不出现

的特异性条带。8.1.5.2 结果判定8.1.5.2.1质控对照成立条件下，两个平行样品均出现

的特异性条带为阳性。8.1.5.2.2 质控对照成立条件下，两个平行样品均不出现

200

bp

的特异性条带为阴性。8.1.5.3结果表述8.1.5.3.1 PCR

产物为阳性者，表述为“检出马驽巴贝斯虫”。8.1.5.3.2 PCR

产物为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。实时荧光

8.2.1 样品的总

同7.1.1操作。8.2.2 荧光定量

mol/L

12.5101010ddH2O

25DB15/T

2835—2022反应体系体积为25

L，见表3。表3 荧光定量

扩增反应体系组成检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。8.2.3反应条件预变性：95

℃，3

min；变性：

95

15

s；延伸退火：58

℃，1

min，个循环。在58

收集荧光信号值。8.2.4结果判定与表述8.2.4.1 质量控制质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)

空白对照：无荧光对数增长，相应的

Ct

值大于等于

40.0；b)

阴性对照：无荧光对数增长，相应的

Ct

值大于等于

40.0；c)

阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的

Ct

值小于等于

35.0。8.2.4.2结果判定8.2.4.2.1 质控对照成立条件下，2

个平行样检测结果

40.0，可判定被检样品为阴性。8.2.4.2.2 质控对照成立条件下，2

个平行样检测结果

35.0，可判定被检样品为阳性。8.2.4.2.3 质控对照成立条件下，至少

1

个平行样检测结果

值

35.0～40.0，并出现典型的扩增曲

DNA

模板量重做实时荧光

PCR

值小于

40.0型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果

Ct

值大于等于

40.0，可判定被检样品为阴性。8.2.4.3 结果表述8.2.4.3.1 检测结果为阳性者，表述为“检出马驽巴贝斯虫”。8.2.4.3.2 检测结果为阴性者，表述为“未检出马驽巴贝斯虫”。9 防止交叉污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T

27403中的规定执行。DB15/T

2835—2022

附 录 A（资料性）溶液配制及提取方法A.1 CTAB-提取缓冲液将5

g

CTAB，20.45

g

，3.03

g

Tris，1.86

g

Na2-EDTA

mL水中，用盐酸调

pH

后，定容至250

mL，115

℃高压15

。A.2 CTAB-沉淀液称0.2

g

CTAB,0.234

g

，定容至100

mL，115

℃高压15

。A.3 1.2

mol/L

NaCl

溶液：称取28

g

NaCl，定容至

mL，115

℃高压15

min。A.4 DNA

提取方法：A.4.1 称取样品

g～1

g加入

mL～3.5

mL

CTAB12

L～20

L蛋白酶K（根据CTAB265

℃至少1

h(过夜孵育最好)样品膨胀，则可再多加每次多1

mL，最多10

。A.4.2 4000

～5000

离心

。A.4.3将上清（约1

mL）加入无菌EP2

mL

L氯仿，涡旋30

s12000

10

min。A.4.4 取上清600

L～

L加入无菌EP2倍体积的CTAB1min。A.4.512000

rpm离心

L的1.2

mol/L

NaCl溶液。（2管合并共用350L溶液）。A.4.6 加入

L氯仿，涡旋30

min，

12000

10

min。A.4.7取上清液至无菌EP0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20

min，12000

rpm离心

，去上清，沉淀用

L

75%的乙醇洗涤，再12000

rpm10

min。A.4.8 去上清后，干燥沉淀，60

℃下15

s～20

sA.4.9 将沉淀溶于100

L灭菌水或TE

或DEPC水中。DB15/T

2835—2022

附 录 B（规范性）马驽巴贝斯虫的目标扩增序列CTCTCCAAAGT