ARMS技术介绍名师制作优质教学资料

ARMS技术的介绍(theamplificationrefractorymutationsystem)主要内容一、 ARMS技术的原理二、 ARMS技术的特点三、 MGB探针及原理四、 MGB探针的特点五、 ARMS技术的应用六、 ARMS实例：0-地中海贫血位占八、、一、ARMS技术的原理突变阻滞扩增系统(ARMS・PCR(amplificationrefractorymutationsystem)),文名等位基因特异PCR(allelespecificPCR,ASPCR)。基本原理：TaqDNA聚合酶缺少3'・5'外切酶活性。在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的己知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的冃的。ARMS技术针对引物3'端进行等位基因特异性的区分。两种引物形式：“normal”野生型引物，扩增时会被突变的模板阻滞；“mutant”突变型引物，扩增时会被野生型模板阻滞。一般情况下，通过引物3'端单个碱基的突变来区分等位基因效果并不理想。所以ARMS技术在大多数情况下还会人为的增加引物3'端附近的碱基的突变以达到区分等位基因的效果。N-6N-4N-2NCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCCTCGACACCGTGCATAAGGCTGTGCTGACC^TCGACGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGAC(iT迎CACCGTOCATAAGGCTCTGCTGACCA西CGccgtgcataaggctgtcctgaccatEgcca5*5,5,5，5'5'CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGgCG5'COGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGicA5'CCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACGPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPriinerprimer7q7f7e7d7c7b7a75'3'TCCAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACgAGAMfiGGACTGAAGCTGCTGGGGCCATOTTmGMSGCC3'AGGTCCGGCACGTATTCCGACACGACTGGTAGCTGcTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCCGOTACAAAAATCT9954N-3Priner8CTCTTTCCCTGACTTCGACGACCCOGGTM5'Priner8aTTCTTTCCCTGACTTCGAgCCCCGGTM5*PriJier8bCTC^TTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTM5'Primer8cTT侦TTCCCTGACTTCGACGACCCCGGTM5'10030以kappacasein基因的一个突变位点为例134hp—34?bp0CASO-IjkUAAABkBBBBBGCASIDFvCA5CI«orCASIPRfi2l4hp:、ARMS技术的特点ARMS技术具有高特异性。由于ARMS所用的引物是从一段序列在3'末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出来的能够区分单个位点等位基因的引物，就保证了其高度的特异性：ARMS技术具有高灵敏性检测限可以达到100copies/mL,对于肿瘤组织检测限可以达到0.5%的突变率。CyclesFig.1-SensitivityofRT-ARMSdetectionofA1762T/G1764Adoublemutationtemplate.Theassaycoulddetect100copies/mLA1762T/G1764Adoublemutation(6).1-6were10\1M,105,101103and100copies/mLofA1762T/G1764Adoublemutationtemplate;and7-9were107copies/mLA1762TandG1764Asinglemutationandwildtemplate.CmoMSI^曜做艸邮好emar(1uu1iIaxivW鮮冊刪Q(%’2二芝芸±-i，貝<<:飞2'了买，須三r二::攵丁二；那住：：■?-「包飞&；计二就7：卩成"*；竺3'三叮咨XMeiW:::'B^T.Tr.:-2j：X?rrr：3i7：s:r:zfrr•F：l:j*:艇曜e冏MIN鼻iuHQUOM谜哼如日瞒區哦3空=卜：笠魚'。，:•.:iMU'： *：'-ZTS.ijecse,Wj?ueaiseczssxeup pu?<s；•*xype^noo/s?Oj?二;tu:EfaKLpu?§p別，扫齐一0_ <号二用二兀ft.KwxaQ”-ago】，b.」e.：呉：.a.—/;0Djerbatooppc'〉、qL^ecep戶®u:*cks?.*'.epz-qe*exeribeu:s-侦b；二r丄^O9.\yy£s勺xepape<^ftwpS>90•P□i/CLCX^J)X9。rr±6X^^；50GACmXIS5Em£L璀33»；—皿0/.S'-di・£(8-£・A；01,€U.5<.>^U吋N£vJ3：7：■山M：Q*.厂“pRJFC*,-K<C9g“呉M？^V-^vs-WinWJ)Dd$WMV3009A 列yrS為%09£kudtupeds%SLeo^Vxmini

guouji^adsagluauj|oeds心曜湃基£6冲I00?dqei?£9?6UMQ%ffZWhIMndqSIAIdVsueujiOQds"勺009Advyari2.3检测时耗短，成本低，结果直观好判读ARMS结合QPCR或者电泳技术，均只需进行一次PCR反应，时耗短。ARMS技术需要优化的仅仅是上游引物，这相对于使用MGB探针的荧光定量PCR技术来说，成本低而且结果直观好判读。mihimurairmin•ipisibi>«n»

—eJ三、TaqmanMGBS针及其原理TaqmanMGB(Taqmanminorgroovebinder)探针由普通taqman探针和MGB基团两部分组成。fluorescentProbeMGB=3'DPljandN-tcmuna]linkeiTaqman-MGBRT-PCR原理四、MGB探针的特点4.1MGB探针的高Tm值由于MBG基团对DNA双链小沟具有高的亲和性，因此在PCR反应中，MGB探针相较于普通探针Tm值要高很多，通常要高出10-20°CoMGB探针的特异性和灵敏性MGB探针具有高的Tm值，可以很好的克服GC含量较低的模板的在探针设计时的困难，等位点突变序列间的Tm值相差很大，提高了检测的特异性。同时，MGB探针包括一个不发荧光的猝灭基团（NFQ）,它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比,从而提供检测灵敏性。检测下限可达到50copiesoMGB探针结果判读定量实验：一对引物，一条MGB探针。一般用于目标位点的定量分析。(csv)SCSMSO3Z定性实验：一对引物，一对探针。一般用于等位基因突变位点的分型。主要使用等位点分型点阵来分析。PmiMT/)xobcbeqxiKC(5‘一3‘)ReporteriS)Qvauhcr(3却FinalcoocefitratiofimM)FoiMiudpriniciGCCCACCGCTCGTCTAANANA450ReverseprimerGATCCCACTGGGAATAGAGAuVGTTCNANA450WikMypeprobeCTACACGCTCCXXiGCCrVICNbQiroMuUnt-typcpobcCTACACGCITCGGCCTFAMNFQ100NA=notapplicable;VIC=6-carboxyrhodamine;FAM=Smboxyfluor心ein:NFQ—nenfluonsscentquencher.••AlleleYhomozygoteclusterHeterozygoteclusterNotemplatecontrol(NTC)AlleleXhomozygoteclusterARMS和MG成针的比较比较项目ARMSMGB需要的引物探针一对引物，一条普通taqman探针一对引物，一对taqmanMGB探针SNP位置SNP位点位于上游引物3'位点SNP位点在探针序列中前期优化成本及时长优化上游引物，序列固定，成本较低，优化时冋较短优化探针序列，序列不固定,成本较高，优化时间较长结果判读根据CT差值或CT值有无来判通过等位点分型点阵，根据点阵分布判读特异性来源多条上游引物筛选出最优引物探针组合；CT差值＞15保证等位位点间的差异通过等位位点序列退火温度Tm值差异保证尽量消除了非特异扩增灵敏性来源前期优化时，通过控制模板量(100-1000copies)保证检测的下限釆用NFQ作为淬灭基团，消除背景信号，增强灵敏度成品试剂盒成本只需一条探针，且探针价格较低，成品试剂盒的成本低需要两条探针，且探针价格较贵，成品试剂盒的成本高五、ARMS技术的应用5.1ARMS技术结合电泳和QPCR技术。目前采用电泳分析仍是主流，结合QPCR的还较少。阿關州MiQO1毛细管电泳*H8T!aB"|nier睡PGI1J4H7I琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳冃前国内用ARMS技术拿证的试剂盒有三个：1、产品名称：人KRAS基因突变检测试剂盒(T