生物工艺发酵液的预处理和固液分离方法

生物工艺发酵液的预处理和固液分离方法第一页，共七十五页，2022年，8月28日214发酵液预处理和固液分离技术手段沉降离心凝聚絮凝过滤固液分离其它手段第二页，共七十五页，2022年，8月28日Bioseparationsusuallybeginwiththeseparationofbiomassfrombroth.Theseparationcommonlyusesfiltrationorcentrifugationasdescribed.Inmanycases,thedesiredproductisinthebroth.Antibiotics,arecommonlyinthebroth;soareextracellularenzymes,manypolysaccharides,andmostaminoacids.Inallthesecases,theseparatedbrothcanbetreatedtoisolateandpurifytheproduct,asabyproduct.第三页，共七十五页，2022年，8月28日生物反应过程第四页，共七十五页，2022年，8月28日预处理的目的①分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质沉淀物）。②除去部分可溶性杂质。③改变滤液的性质（以提高过滤速度）。第五页，共七十五页，2022年，8月28日2.1 发酵液的预处理发酵液预处理原因？

⑴发酵液中菌体细小、粘度大。粘性杂质多，难直接过滤。对细菌和某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤。由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊，滤速极慢。第六页，共七十五页，2022年，8月28日⑵发酵液中高价无机离子及杂蛋白的存在。影响离交法的交换容量。影响离交法及大网格树脂的吸附能力。产生乳化。影响膜过滤。文献：青霉素发酵液中可溶性蛋白质的沉降及其在溶剂萃取中的乳化作用第七页，共七十五页，2022年，8月28日2.1.1 高价无机离子的去除方法：(1)去Ca2+，加草酸。作用：⑴生成草酸钙沉淀，同时也生成MgC2O4↓⑵草酸钙沉淀，能促使蛋白质凝固。(2)去Mg2+，加三聚磷酸钠Na5P3O10，同时也可去除Ca2+Na5P3O10+Mg2+→MgNa3PO10+2Na+

（络合物）(3)去Fe3+，加黄血盐，形成普鲁士兰沉淀。Fe3++[Fe2+(CN)6]4-+K+=K[Fe2+(CN)6Fe3+]第八页，共七十五页，2022年，8月28日杂蛋白的去除方法：(1)酸化，调pH值至等电点。（HCO2、H2SO4、HCl、H3PO4）(2)加盐，形成沉淀。酸性溶液：Protein+阴离子→↓碱性溶液：Protein+阳离子→↓

第九页，共七十五页，2022年，8月28日(3)加热，使蛋白质变性沉淀，同时μ↓，加快过滤速度。缺点：原液的色素增多，影响原液质量，只适用于对热不敏感的生化物质。

第十页，共七十五页，2022年，8月28日如：链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。第十一页，共七十五页，2022年，8月28日(4)加有机溶剂，表面活性剂。所处理的量较小。(5)大幅度改变pH值。第十二页，共七十五页，2022年，8月28日(6)吸附作用几种反应剂相互作用，或和某些溶解盐类发生反应生成不溶解的沉淀[CaSO4、AlPO4]。生成的沉淀的作用：能防止菌丝体粘连，使菌丝具有块状结构。沉淀本身可作为助滤剂。使胶状物和悬浮物凝集。第十三页，共七十五页，2022年，8月28日如：四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋白质。环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、镁离子。第十四页，共七十五页，2022年，8月28日15(7)凝聚和絮凝凝聚：在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝：在高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程，是以物理集合为主的过程。第十五页，共七十五页，2022年，8月28日凝聚：胶体粒子中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）。

机理：

a中和粒子表面电荷

b消除双电层结构

絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成10mm大小絮凝团的过程

。机理：架桥作用

第十六页，共七十五页，2022年，8月28日2.1.3.4 凝聚作用：⑴发酵液的带电特性：①发酵液中的胶体粒子表面，一般都带有负电荷。②发酵液中的胶粒子在界面上形成双电层。⑵扩散双电层结构模型：第十七页，共七十五页，2022年，8月28日18第十八页，共七十五页，2022年，8月28日由于①吸附作用正离子被吸附②热运动正离子有离开表面的趋势①②两相反作用的影响：形成吸附层或紧密层：距离胶核表面约一个离子半径的stern平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面。第十九页，共七十五页，2022年，8月28日20几个名词：stern层：相距胶核表面约一个离子半径的平面。滑移（动）面：当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大。φs：胶核表面的电位

φd：stern平面上的电位ξ：滑移面上的电位，可测定，控制胶粒间电排斥作用的电位，表征双电层的特征第二十页，共七十五页，2022年，8月28日⑷胶粒能保持分散状态的原因：带有相同电荷和扩散双电层的结构。水化层的形成:依赖于胶体带电。第二十一页，共七十五页，2022年，8月28日22扩散层的有效厚度，即stern面上的电位φ降低到其值为1/e处的距离，不能直接测定。水的介电常数胶体的电动电荷密度即滑移面电荷密度(5)胶粒发生凝聚的机理第二十二页，共七十五页，2022年，8月28日第二十三页，共七十五页，2022年，8月28日24凝聚价（凝聚值）①定义：胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔/升）。②规律性：阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+

＞Fe３+＞H+＞Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Li+凝聚的缺点：凝聚体颗粒较细小，有时不能有效分离。第二十四页，共七十五页，2022年，8月28日25絮凝预处理方法中的除杂效率最高的方法。絮凝剂：有机高分子水溶性聚合物，具有长链线状的结构，分子量可达数万至一千万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）⑵絮凝作用机理。第二十五页，共七十五页，2022年，8月28日26第二十六页，共七十五页，2022年，8月28日第二十七页，共七十五页，2022年，8月28日28⑶作为絮凝剂的条件：分子中必须必须有长链线状的分子结构，含有较多的活性基团，可以带多价电荷，能和悬浮颗粒表面相结合。水溶性的聚合物，分子量可以很高。不影响产物的性能。无毒。第二十八页，共七十五页，2022年，8月28日29⑷絮凝剂的类型：细胞絮凝的种类：自身絮凝（酵母）、絮凝剂絮凝絮凝剂类型：化学结构：高聚物、无机盐（硫酸铝、氯化钠、磷酸钠、氯化钙和明胶等）、有机溶剂（乙醇、丙酮、甲醛）、表面活性剂官能团：阴、阳离子、非离子来源：天然和人工合成第二十九页，共七十五页，2022年，8月28日30聚丙烯酰胺优点：

用量少10－6g/L絮凝体粗大，分离效果好。絮凝速度快种类多。主要用于杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液缺点：存在毒性（尤其阳离子）。第三十页，共七十五页，2022年，8月28日31聚丙烯酸类阴离子絮凝剂。无毒。聚苯乙烯类衍生物无机高分子聚合物天然有机高分子絮凝剂壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶、海藻酸钠等。微生物絮凝剂

微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。第三十一页，共七十五页，2022年，8月28日32⑸混凝包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。对带负电性菌体或蛋白质：①加入无机电解质，凝聚起作用成微粒：②再加入非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，架桥作用（絮凝）：，第三十二页，共七十五页，2022年，8月28日33絮凝剂浓度影响絮凝因素第三十三页，共七十五页，2022年，8月28日34pH值第三十四页，共七十五页，2022年，8月28日絮凝剂分子量与搅拌速度，时间有关。第三十五页，共七十五页，2022年，8月28日文献：新型絮凝剂F－717对抗生素M－90发酵液预处理研究微生物细胞的絮凝与微生物絮凝剂肌苷发酵液絮凝除菌体的研究第三十六页，共七十五页，2022年，8月28日37最新的发展趋势亲和絮凝第三十七页，共七十五页，2022年，8月28日发酵液的固液分离38第三十八页，共七十五页，2022年，8月28日39发酵液的过滤：

过滤：液固分离的过程。要求：滤速快，滤液澄清，产品高收率。第三十九页，共七十五页，2022年，8月28日40发酵液的过滤特性和滤饼的重量比阻：发酵液大多数属于非牛顿型液体，滤渣为可压缩性。rB：滤饼的重量比阻。衡量不同发酵液过滤的难易程度。1.不可压缩性滤饼，rB常数，m=02.可压缩性滤饼：(发酵液属于此类)rB=r(△p)m

结论：△P↑→γB↑

问：若在开始过滤时就迅速提高压差吗？第四十页，共七十五页，2022年，8月28日41

对于可压缩滤饼，如果过滤介质的阻力相对较小，可以忽略不计，则恒压下的过滤方程式为（1-2）式中q：到瞬间τ时，通过单位过滤面积的滤液量，m3/m2；△P：过滤压力差，Pa；

rB：滤饼的质量比阻，m/kg；

XB：通过单位体积滤液所形成的滤渣质量，kg/m3；

τ：过滤时间，s；

μ：滤液粘度，Pa·s。第四十一页，共七十五页，2022年，8月28日42

利用图解法求得，以τ/q为纵坐标，以q为横坐标所得的直线斜率为M，则rB可按下式进行计算：

（1-3）根据滤饼的质量比阻，可以衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。

第四十二页，共七十五页，2022年，8月28日43影响过滤速度的因素。

菌种真菌：过滤容易，滤渣呈紧密饼状，易刮下。放线菌：菌丝细而分枝，交织成网状，过滤较难，须经预处理。细菌：菌体很细小，过滤十分困难，须絮凝处理，并用特殊的过滤设备。第四十三页，共七十五页，2022年，8月28日44

培养基组成

影响很大。用黄豆饼粉，花生粉作氮源，淀粉作碳源会使过滤困难。后期加用消沫油或大量未用完的培养基，使过滤困难。续第四十四页，共七十五页，2022年，8月28日45

发酵工艺

发酵时间：在菌丝自溶前必须放罐，否则过滤困难。

搅拌速度、通气量，接种比例影响微生物的生长特性。低接种量，高搅拌速度有利于生成块状和丸团沉淀。第四十五页，共七十五页，2022年，8月28日46第四十六页，共七十五页，2022年，8月28日47改善过滤性能的方法若难过滤的发酵液，设法改善过滤性能，降低γB，提高过滤速度。方法：等电点法；蛋白质变性法；吸附法；凝聚及絮凝法；加入助滤剂；酶解作用。第四十七页，共七十五页，2022年，8月28日48加入助滤剂：助滤剂：不可压缩的多孔微粒，不吸附或很少吸附生化物质，使滤饼疏松，有利于过滤。种类：硅酸盐粉末，纸浆，珠光岩，珍珠岩（SiO2）助滤剂的加入有两种方法：在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)，该方法，会使滤速降低，但滤液透明度。直接加入发酵液中。第四十八页，共七十五页，2022年，8月28日49加入酶

发酵液中有不溶性的多糖存在，则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。如：万古霉素发酵液，加0.0025%的细菌淀粉酶，搅拌0.5hr，2.5%硅藻土助滤剂，υ↑5倍。

发酵液染菌的处理：升高温度，增加催化剂用量，加助滤剂。第四十九页，共七十五页，2022年，8月28日50固—液分离设备的选择常用于发酵液的分离设备有：板框压滤机鼓式真空过滤机离心沉降分离机第五十页，共七十五页，2022年，8月28日51板框压滤机优点：板框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低，动力消耗少等优点。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。第五十一页，共七十五页，2022年，8月28日52鼓式真空过滤机优点能连续操作，能实现自动化控制缺点压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。第五十二页，共七十五页，2022年，8月28日53离心分离

优点分离速度快，效率高，操作时卫生条件好等优点，适合于大规模的分离过程。缺点投资费用高，能耗较大。第五十三页，共七十五页，2022年，8月28日54离心，与过滤比较优点：分离速度快、效率高、液相澄清度好，操作时卫生条件好优点，适于大规模分离过程缺点：投资设备高，能耗大，固相干燥程度不如压滤操作。第五十四页，共七十五页，2022年，8月28日第五十五页，共七十五页，2022年，8月28日第五十六页，共七十五页，2022年，8月28日第五十七页，共七十五页，2022年，8月28日有哪些形式离心呢？重力沉降（自己离心自己）离心过滤离心沉降离心分离58第五十八页，共七十五页，2022年，8月28日59 重力沉降以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受到重力，浮力和摩擦力的作用对球形的固体颗粒，当10-4<Re<1时(滞流区),当重力，浮力和摩擦力达到平衡时，球形固体颗粒沉降，沉降速度为第五十九页，共七十五页，2022年，8月28日60离心沉降1、离心力

F=ma∵

其中：r：旋转体离旋转轴距离

ω：旋转角速度

v：旋转线速度

n：每秒钟转数第六十页，共七十五页，2022年，8月28日61相对离心力（离心分离因数，离心力强度）悬浮粒子受到离心力的作用，将向离心管底部移动，沉降，这个粒子所受到的离心力与它受到的地球重力相比较，称为相对离心力（RCF），也称为分离因子。

从以上公式可看出RCF是与沉降的粒子质量无关的值。第六十一页，共七十五页，2022年，8月28日62沉降速度及沉降系数

s为单位离心场力作用下的粒子的沉降速度。从以上得知：s是溶剂物性的函数，与温度及溶剂有关。S=10-13秒第六十二页，共七十五页，2022年，8月28日63一些蛋白质的沉降系数第六十三页，共七十五页，2022年，8月28日64 沉降时间下列积分：圆形颗粒完全沉降需要的时间第六十四页，共七十五页，2022年，8月28日65K是转子的效率因子（通常K值为10—1,000或更大）。与转子大小和速度有关。根据厂家提供的最大K值就可估计在一定的转速时具有一定沉降系数的某种颗粒的沉降时间。BACK第六十五页，共七十五页，2022年，8月28日66按离心形式分①离心过滤：在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮液的过程为离心过滤②离心沉降：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或管子中进行悬浮液沉降分离者为离心沉降。③离心分离：分离不同比重液体的过程为离心分离。第六十六页，共七十五页，2022年，8月28日67按离心的转速分第六十七页，共七十五页，2022年，8月28日离心方法差速离心区带离心68第六十八页，共七十五页，2022年，8月28日69差速离心法：

采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心的方法。它是利用各种粒子密度的不同，因而在离心力场中其沉降速度亦不同，从而达到分离的目的。第六十九页，共七十五页，2022年，8月28日70缺点：每次沉降的沉淀粒