蛋白质组学-蛋白质组学相关技术及发展文献综述

蛋白质组学相关技术及发展文献综述1概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组(proteome)这个概念，该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成，并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”[1]。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的，而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质[2]。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能，这将有助于识别各种特异蛋白[3]，目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛,其运用技术主要是双相凝胶电泳（Two-dimensionalgelelectrophoresis，2DE）技术以及图像分析系统,当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变，这些技术可以直接测定蛋白质的含量，并有助于发现蛋白质翻译后的修饰，如糖基化和磷酸化等[4]。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来，酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法，同时研究者也将此方法不断改进[5]。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的[4]。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛，其分析通常有三个步骤：第一步，运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质；第二步，应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质；第三步，应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳，其中应用最多的是双向电泳技术，其他还有SDS、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱，通常使用高效液相色谱(HPLC)和二维液相色谱(2D-LC)。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳（two-dimensionalgelelec—trophoresis，2DE)这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术，产生于20世纪70年代中叶，但主要的技术进步(如实验的重复性、可操作性，蛋白质的溶解性、特异性等)是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦(IEF)电泳，根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子，根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点（pI）是蛋白质所带静电荷为零时的pH，周围pH小于其pI时，蛋白质带正电荷，大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时，蛋白质处于一个pH梯度中，在电场的作用下，蛋白质将移向其静电荷为零的点，静电荷为正的蛋白将移向负极，静电荷为负的将移向正极，直到到达其等电点，如果蛋白质在其等电点附近扩散，那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应，它可以在等电点附近浓集蛋白，从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下，两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差，80年代以后，研究人员研制了固定pH梯度的胶条（IPG）。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子，每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时，将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合，两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂，不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂，它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电，所带电荷与蛋白质的分子量成正比，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS装置有水平和垂直两种形式，垂直装置可同时跑多块胶，如AmershampharmaciaBiotech的EttanDALTII系统可同时跑12块胶，提高了操作的平行性。经过2DE以后，二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白，这样成千种不同的蛋白即可被分离，有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得到。蛋白质组学分析对2DE后的染色技术要求很高，除了标准的敏感性要求外，还要求染色技术的线性和均一性[6]。目前有多种染色方法，如考马斯亮蓝染色、银染色、及荧光染色等。银染比考马斯亮蓝染色灵敏度高，已有学者对这两种方法进行了比较，如PhillipCash等在检测肺炎链球菌红霉素敏感株和抵抗株表达的蛋白时，用考马斯亮蓝G-250染色，发现了200多种蛋白，PI4-7，分子量15000-110000，在相同的PI和分子量范围下用银染检测到360多种蛋白[7]。但是银染的线性效果并不是很好，并且对质谱分析干扰大。考马斯亮蓝染色线性、均一性较高,对质谱干扰较小,但其敏感性较低。较理想的是荧光染色，ThierrryRabilloud等比较了两种荧光剂RuBps和SyproRuby的效果，发现其敏感性、线性都很好，对质谱干扰小[6]，但其成本较高。实验时，可以根据不同的目的选用不同的方法。2DE图像所产生的大量蛋白质点是单纯用肉眼分析无法完成。目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析，如MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,又称2DImageMasterElite(AmershamPharmaciaBiotech)等，这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对，一般分析一个图像需要8-10h。2DE是目前唯一的一种能溶解大量蛋白质并进行定量的方法，具有高通量、重复性好、敏感性较高等优点[8]。它能同时分离和定量数千种甚至上万种蛋白[8]。它的分辨率极高，等电聚焦相可以区分PI相差0.1的蛋白质，SDS相可以区分分子量相差1kD的蛋白质[9]。其缺点是由于蛋白表达水平的差异较大，一些低丰度的蛋白不易检测[8,10]。另外某些基因的表达产物在2D胶中呈多点或不同基因的表达产物共点，使2D胶数据的比较、定量更加复杂[8]。2DE分离的蛋白数量受诸多因素影响，疏水性的膜蛋白（往往是药物设计最好的靶点）很难用此法分离，同时染色技术的灵敏度和线性范围不足以呈现所有分离的蛋白质。目前，人们采用多种方法来减少这些缺点，如通过增加上样量分离低丰度蛋白，应用窄范围固定pH梯度胶条、蛋白层析等技术提高分离的蛋白数目，应用荧光染色提高检测灵敏度等。3.1.2双向荧光差异电泳双向荧光差异电泳(two—dimensionaldifferencegelelectrophoresis，2D—DlGE)2D—DIGE分析系统是在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，且软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，这样可以很好地去除样品的假阳性差异点。DIGE技术可检测到表达差异小于10％的蛋白，统计学可信度达到95％以上。利用EttanDIGE技术还可以对微量(少到5μg)样品进行蛋白质组学分析。2D-DIGE的具体操作过程与常规2DE的步骤相似，所不同的就是在样品制备时，在每份样品中预先分别加入不同的荧光染料，并且需要制作一个供其他样品比较的内参，另外在电泳后的凝胶显色时需要在特殊的荧光检测仪中进行。3.1.3液相色谱高效液相色谱因具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点，广泛应用于生产实践中。高效液相色谱是利用高压输液泵驱使带有样品的流动相通过装填固定相的色谱柱，利用固液相之间的分配机理对混合物样品溶液进行分离的方法。例如对奶粉中三聚氰胺的检测[11]。二维或多维液相色谱，是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维的色谱柱进入接口中，通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物(如肽)分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用(亲和)等。在一维分离系统中不能完全分离的组分，可能在二维系统中得到更好的分离，分离能力、分辨率得到极大的提高。完全正交的二维液相色谱，峰容量是两种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。3.2目的蛋白点的筛选对目的蛋白的筛选通常与双向电泳连用，主要用来分析凝胶中分离出的蛋白质样品，采用的主要技术手段通常是Western印迹和差异蛋白比较分析。Western印迹主要是将双向电泳后的凝胶不经过染色而直接转印到固相支持物(如NC膜、PVDF膜等)上，再在膜上进行免疫学反应，从而筛选出与免疫功能相关的蛋白；差异蛋白比较分析则是先对凝胶进行染色，然后应用软件(如ImageMaster、PDQuest等)对存在差异的2组凝胶进行比较，从而找出差异的蛋白。在比较时，通常要求每个被分析的样品重复3次，然后先做组内比较，再做组间比较。3.3蛋白质鉴定技术对2DE所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。3.3.1一级质谱质谱技术的高速发展，目前可以快速、高效地对目的蛋白进行鉴定，且样品用量少(通常达到微克级)。除此之外，质谱技术还可以对蛋白质翻译后修饰进行分析。根据离子源的不同，质谱主要包括基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDITOFMS)、电喷射离子井飞行时间质谱(ESI—TOFMS)。常用的质谱分析仪除了飞行时间(TOF)外，还有四级杆(Q)、离子井，而在串联质谱中通常使用的是Q—TOF或TOF—TOF等。2种离子源都可以使肽段、蛋白、药物的代谢产物、寡核苷酸等其他碳水化合物离子化，进而被质谱仪分析。通常的质谱仪一般由样品槽、离子源、分析仪和检测器组成。由于单一地依靠蛋白质相对分子质量并不能对目的蛋白进行理想的鉴定，因此须事先用蛋白酶(如胰蛋白酶)将检测样品酶解成不同长度的肽段。在MALDI—TOF质谱中还需要向样品中加入基质，以促使样品离子化(离子化的确切基质目前还不清楚)，然后在离子源的作用(激光激发)下使样品变为气相离子。这些被激发的气相离子进入质量分析仪，根据其荷质比而把肽段进行区分。质谱的整个过程都是在真空条件下进行的。ESI则不需要基质辅助，而是使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离。3.3.2二级质谱二级质谱同时将2个上述质谱连接在一起构成的串联质谱，可以更精确、更灵敏地分析蛋白样品。二级质谱的使用，使得质谱不仅可检测肽段的相对分子质量，还可以检测它的氨基酸序列。利用质谱仪的第一个分析仪对蛋白样品进行初步检测，从样品混合中选择特定的肽段，再将这个特定的肽段与惰性气体(如氮气、氩气等)碰撞，从而将肽段进一步离解。在被选择的肽段与惰性气体发生能量碰撞时，支持蛋白主链构象的化学键受到破坏，碰撞后的结果再被第二级质谱分析仪分析。串联质谱又叫碎片谱或MS／MS谱。在二级质谱中，可以将差别只有1个氨基酸的相邻肽段区分开。因此通过分析临近峰的相对分子质量，可以检测肽段的氨基酸序列旧。3.3.3肽质量指纹图谱肽质量指纹图谱(peptideInas$fingerprint—ing，PMF)当被离子化的肽段经过质谱仪时，这些肽段因其相对分子质量的不同而被分离，因此产生了含有不同峰值的肽质量指纹图谱。蛋白质鉴定便是通过对PMF的分析实现的，即将所得到的PMF与已知数据库中一个蛋白的理论期望蛋白酶肽段进行比较，可以得到一个匹配程度得分，当这个得分高于理论计算的得分时，便认为该蛋白是理论中的蛋白。这些已知数据库在互联网上有很多，其中NCBI和EBI的数据库是最大的，而且是免费的。在搜索这些数据库时，需要使用搜索软件如Mascot、PepSea、PeptideSearch等，其中Mascot是最常用的软件。最近开发了一个新的程序Paragon，该程序克服了Mascot被动的、概率的、估计的搜索模式所带来的缺点，被认为是Mascot的替代者旧。质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前MS/MS是唯一能够迅速测序N末端封闭或共价修饰肽段的方法[12]。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受[12]，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏[10]，在一些情况下，仅需10-15fmol的蛋白[10,13,9],这在只能得到极少量蛋白的情况下鉴别蛋白是很有用的。在实际工作中可将几种技术结合应用，如串联质谱与Edeman微测序技术相结合[12]，MALDI质谱与纳米电子喷射质谱相结合[14]，这些技术相互互补，为分析2DE所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。质谱技术是一项强大的分离分析技术，但它只能分离气体状态的带电分子，而且，一次只能分析带正电或带负电的分析物。质谱分析很难区分两种同源性极高的蛋白。由于质谱分析只是描述蛋白的少量多肽，因此可能把删节的蛋白当成是原来的蛋白。通常只适用于象酵母等基因组序列已知的个体。3.4酵母双杂交技术酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,简称为DB)和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录，而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白具有激活转录的功能。DB与AB分别能与多肽X和Y结合，由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(preyortargetprotein)。如果在X和Y之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reportergene)。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用[15]。用酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用通常会存在假阳性或假阴性的问题，已有许多学者对此系统进行了改进，并且将其扩展到检测DNA-蛋白质，RNA-蛋白质，小分子-蛋白质之间的相互作用上[16]。3.5蛋白质样品的生物信息学分析分子生物学的发展把生命活动的物质基础追溯到核酸和蛋白质两大类生物大分子,它们构成了生物数据的主要部分。关于这些生物大分子的结构、相互作用和功能的研究，也产生着大量数据。3.5.1蛋白功能的预测蛋白功能的预测可以通过3条途径实现。首先，通过与已知蛋白质序列相比较来检测蛋白的功能。此外，蛋白质的一些其他性质可以直接由序列分析得到。比较常用的蛋白质序列数据库是SwissProt、P1R和NCBI的Blast，其次可以通过蛋白质的物理性质的预测。蛋白质的一些功能特征可以通过蛋白序列直接推算出来，通过组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学性质分析已知或未知蛋白质的性质，如等电点／相对分子质量、疏水性、跨膜螺旋、卷曲螺旋及信号肽等。除了上述2种方法外，还可以与保守的基序和图形数据库比较判断功能。对于那些与数据库中已知功能蛋白质无同源性的序列或找到同源性的蛋白质功能为未知时，我们可与保守的基序比较来判断其功能。基序数据库中最为常用的是网站Prosite。3.5.2蛋白结构的预测虽然有时蛋白质的序列相似，但是却执行着不同的功能；或同源基因编码的蛋白质，虽然序列差别很大，但是对于生物体来说执行的却是同样的功能。这主要是因为蛋白质的空间结构发挥了作用。在PDB等数据库中可以检索到一些蛋白质高级结构的同源性。蛋白质二级结构预测的基本依据是每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。因此，进行二级结构预测需要通过统计和分析发现这些倾向或者规律。蛋白质二级结构预测的方法有3种。一是由已知结构统计各种氨基酸残基形成二级结构的构象趋势，其中最常用的是Chou和Fasman法；二是基于氨基酸的物理化学性质，包括堆积性、疏水性、电荷性、氢键形成能力等；三是通过序列比对，由已知三维结构的同源蛋白推断未知蛋白的二级结构。一般对于α螺旋预测精度较好，对β折叠差些，而对除α螺旋和β折叠等之外的无规则二级结构则效果很差。蛋白质三维结构的预测是最复杂和最困难的预测技术。序列差异较大的蛋白质序列也可能折叠成类似的三维构象。由于蛋白质的折叠过程并不十分清晰，从理论上解决蛋白质折叠的问题还有待进一步的科学发展，但也有一些有一定作用的三维结构预测方法，如与已知结构的序列比较、同源模建、threading算法和折叠识别方法。尽管生物信息学发展迅猛，但是它仍然不能承载所有的研究信息。虽然通过在生物数据库网站内检索可以得到一定的分析结果，但这个分析结果可能并不完整，比如细菌中的有些蛋白不仅对于机体来说发挥正常代谢的功能，而且该蛋白还具有一定的致病性，而后者基本上无法通过生物信息学网站分析得到，这就需要阅读大量的文献以获得更完整的信息。4蛋白质组学的应用蛋白质组学的应用为医学、生命科学等研究领域提供了新的思路，并且带来了较为丰硕的结果。目前，在原核生物、真核生物以及多细胞生物体研究中都有广泛应用。如对霍乱弧菌[17]以及大肠杆菌[18]在不同酸碱条件下蛋白表达的变化的研究，表明这些病原菌会随环境的改变而调节蛋白表达以使其达到最大的致病能力。在真核生物研究方面，MichelPerrot等用2DE及质谱、免疫杂交、微量测序等方法分离和鉴定了酿酒酵母的401种蛋白，309种以前曾报道过，剩余的92种是新发现的，从而拓展了酵母参考图谱，为研究细胞功能、酵母翻译因子靶点提供了条件[10]。应用蛋白质组学技术还可能实现癌症的早期诊断120l。在致病微生物方面同样硕果累累。蛋白质组学的应用可以实现高通量、高效率地对样品进行分析，并可以同时得到多个重要的研究结果。5存在的不足尽管蛋白质组学应用前景广阔、研究成果丰硕，但仍然存在许多不足。如2DE的灵敏度虽然已达fmol水平，但仍难将细胞组织内多种痕量调控蛋白分离显示出来，而此类蛋白对于基础与应用研究都极为重要(甚至比高含量结构蛋白更为重要)。此外，现有质谱技术虽然在蛋白质组成分的鉴定中高效、灵敏、特异，但仪器价格十分昂贵，因此技术推广受到很大的限制。还有，现今的蛋白质组研究仍局限于对已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析闭。未来的蛋白质组学应该摆脱基因组学的束缚，在真正意义上实现蛋白质的体外合成、体外加工与修饰，以及简单方便的蛋白测序与鉴定等。6展望目前有约60种微生物的全基因组序列已经测出,DNA序列信息仅提供了细胞运用其基因的所有可能方式的一种静态瞬间快照,蛋白质组学则研究基因编码的活动怎样发生和什么时候发生(如蛋白翻译),以及非基因编码的活动之间的关系(如蛋白质翻译后的修饰或蛋白质、核酸、脂类、糖类之的相互作用)。因为实际蛋白数量反映了翻译的能力和效率、翻译后的修饰和每个蛋白的转化比率，蛋白质组学分析给基因表达最终产物的研究提供了信息。因此它是对翻译水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达必不可少的一种手段，它的发展将给分子生物学领域带来革命性变化。参考文献[1]WilkinsMRSanchezJC，CooleyAA，eta1．Progresswithproteomeprojects：whyallproteinsexpressedbyagenomeshouldbeidentifiedandhowtOdoit[j]．BiotechnolGenetEngRev，1996，13：19-50．[2]deHoogCL'MannM．Proteornics们．AlmuRevGenomicsHumGenet，2004，5：267—293．[3]AndersonNL,MathesonAD,SteinerS.Proteomics:applicationsinbasicandappliedbiology.CurrentOpinioninBiology,2000,11:408-412.[4]WalterP.,Blackstock,WeirMP.Proteomics:quantitativeandphysicalmappingofcellularproteins.Tibtech,March,1999,17:121-127.[5]CenciarelliC,ChiaurDS,GuardavaccaroD,etal.IdentificationofafamilyofhumanF-boxproteins.CurrentBiology1999,9:1177-1179.[6]RabilloudT,StrubJM,LucheS,etal.AcomparisonbetweenSyproRubyandrutheniumIItris(bathophanthrolinedisulfonate)asfluorescentstainsforproteindetectioningels.Proteomics2001,1:699-704[7]CashP,ArgoE,FordL,etal.AproteomicanalysisoferythromycinresistanceinStreptococcuspneumoniae.Electrophoresis1999,20:2259-2268[8]GygiSP.,CorthalsGL,ZhangY,etal.Evaluationoftwo-dimensionalelectrophoresis-basedproteomeanalysistechnology.PNAS,August15,2000,97(17):9390-9395.[9]HendricksonRC,DouglassJF,ReynoldsLD,etal.MassspectrometricidentificationofMtb82,anovelserologicalmarkerforTuberculosis.Journalofclinicalmicrobiology,June2000,2354-2361[10]PerrotM,SaglicoccoF,MiniT,etal.Two-dimensionalgelproteindatabaseofSaccharomycescerevisiae(update1999).Electrophoresis,August;1999,20(11):2280-98[11]冯楠，路勇，吴颖，等．超高效液相色谱串联质谱法(UPLC—MS／MS)测定多种食品中三聚氰胺的残留量叨．中国卫生检验杂志，2009．19(2)：248—250．[12]HallSC,SmithDM,MasiarzFR,etal.MassspectrometricandEdmansequencingoflipoc