DNA重组技术的基本工具

武汉加油！中国加油！！在家认真学习就是对国家的最大支持期待我们能够早日战胜疫情，在校园相见！期待我们能够早日战胜疫情，在校园相见！为了棉花姓“中国”1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害以迅雷不及掩耳之势吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。棉花棉铃虫幼虫为了棉花姓“中国”1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种——中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种——中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性，我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！

2017年10月13日,农业部种子管理局副局长吴晓玲在回答媒体提问时表示,目前中国自主选育的转基因棉花品种市场份额占到95%以上,国外品种不到5%。1999-2006年中国抗虫棉市场发展状况基因工程1.简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。一二一、基因工程的定义基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。什么是基因工程？指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。（课本P1）DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物基因重组【归纳定义】工程别名：操作环境：操作对象：操作水平：

工程实质：

工程产物：基因工程的理论基础：（课本P2）1944年，艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验：

证明DNA是生物的遗传物质，DNA可以从一个生物个体转移到另一个生物个体。基因工程的理论基础：（课本P2）1953年，沃森和克里克建立DNA双螺旋模型；1958年，梅塞尔松和斯塔尔的实验证明DNA的半保留复制；随后不久确立中心法则：

阐明遗传信息的流动方向。基因工程的理论基础：（课本P2）1963年,尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码；1966年,霍拉纳实验证明遗传密码的存在：

自然界中的生物共用一套遗传密码，为基因的分离和合成等提供理论依据。基因工程的技术发展：（课本P2-3）1967年，找到基因转移的运载工具。1970年，发现多种工具酶。1965年，发明氨基酸序列分析技术；1977年，发明DNA序列分析的方法。1972年，伯格构建第一个体外重组DNA分子。基因工程的技术发展：（课本P2-3）1973年，博耶和科恩的重组DNA表达实验成功。标志基因工程正式问世。1980年，培育出世界第一个转基因小鼠；1983年，培育出世界第一例转基因烟草。1988年，穆里斯发明PCR（聚酶链式反应）技术，这是一项能够在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。抗虫棉的培育有哪些关键操作步骤？培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因普通棉花(无抗虫特性)棉花细胞(含抗虫基因)与运载体DNA拼接，导入棉花植株(有抗虫特性)表达抗虫基因（BT毒蛋白基因）思考：解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些分子工具呢？关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞01DNA重组技术的基本工具自主学习：请同学们快速浏览选修三课本第4-6页，思考以下问题：1、基因工程中需要哪些基本工具？2、这些基本工具的作用分别是什么？DNA重组技术的基本工具：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体二、DNA重组技术的基本工具1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(1)主要来源:原核生物。(2)作用:能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)结果:形成DNA片段。限制酶切割DNA分子产生的DNA片段末端有两种形式,即黏性末端和平末端。一二2.DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,拼接成新的DNA分子。3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)载体的条件①能够在受体细胞中自我复制。②有一至多个限制酶切割位点,便于外源基因的插入。③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。④在宿主细胞内友好借居,不影响宿主细胞的生命活动。⑤分子大小应合适,以便提取和体外操作。(2)载体的种类①质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外、能够自我复制的小型双链环状DNA分子。含有一个至多个限制酶切割位点,供外源基因插入其中,并带有特殊的标记基因,是基因工程最常用的载体。②λ噬菌体的衍生物③动植物病毒一、限制性核酸内切酶（阅读课本P4-5，完成下表）来源种类特点作用结果主要是原核生物约4000种1.识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列2.使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开形成两种末端：黏性末端和平末端①为什么原核生物中存在限制酶？这些酶的作用是什么？②如何理解限制酶对双链DNA分子的特异性识别和切割？③什么是黏性末端和平末端？这两种末端是如何形成的？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原体的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中起到切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。因为限制酶识别DNA的特定核苷酸序列，所以不会伤害到自身的遗传物质。（课本P4“寻根问底”）①为什么原核生物中存在限制酶？这些酶的作用是什么？限制酶②如何理解限制酶对双链DNA分子的特异性识别和切割？G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A磷酸二酯键TGCCGTAA仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。【反馈练习】下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGD两种常用的限制酶：EcoRⅠ和SmaⅠEcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。EcoRⅠ：特异性识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRⅠSmaⅠ：特异性识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。SmaⅠ③什么是黏性末端和平末端？这两种末端是如何形成的？……G……CTTAAAATTC……G…………CCC……GGGGGG……CCC……经EcoRⅠ切割后经SmaⅠ切割后……GAATTC…………CTT

AAG…………CCCGGG…………GGG

CCC……中心轴线……G……CTTAAAATTC……G…………CCC……GGGGGG……CCC……黏性末端平末端限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA两条链分别切开，DNA两条单链的切口带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对。限制酶在识别序列的中心轴线处将DNA两条链切开。练习使用EcoRI剪切目的基因……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？（2）在笔记本上写出EcoRI切割后的所产生的末端和目的基因片段。练习使用EcoRI剪切目的基因……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。会产生相同的黏性(平)末端基因的针线：DNA连接酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用EcoRI切割DNA片段1DNA片段2重组DNA片段二、DNA连接酶（阅读课本P5-6，完成下表）项目内容种类作用对象作用原理作用结果T4DNA连接酶E·coliDNA连接酶可作用于黏性末端和平末端只作用于黏性末端DNA片段形成磷酸二酯键形成重组DNA分子AATTCGGCTTAADNA连接酶的作用AATTCGGCTTAADNA连接酶的作用判断以下说法是否正确：（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接起来。（2）T4DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。判断以下说法是否正确：（1）两个DNA片段的黏性末端必须互补才能通过DNA连接酶连接起来。（2）T4DNA连接酶连接平末端的效率和连接黏性末端的效率相同。（3）DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。比较区分：DNA连接酶和DNA聚合酶（课本P6“寻根问底”）

比较项目DNA连接酶DNA聚合酶不同点作用对象作用过程模板作用结果相同点作用实质化学本质双链DNA片段重组DNA分子不需要模板形成重组DNA分子单个脱氧核苷酸连接成一条与模板链互补的DNA单链DNA复制需要DNA一条链为模板形成新的DNA分子都是形成磷酸二酯键蛋白质根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键【反馈练习】三、基因进入受体细胞的载体（阅读课本P6，完成下表）项目内容载体类型作用条件假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能产生预想的性状吗？霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它做载体吗？如果载体没有切割位点将会怎样？如何确定目的基因是否进入受体细胞中了？三、基因进入受体细胞的载体（阅读课本P6，完成下表）项目内容载体类型作用条件质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等将外源基因送入受体细胞的工具假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能产生预想的性状吗？霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它做载体吗？如果载体没有切割位点将会怎样？如何确定目的基因是否进入受体细胞中了？对受体细胞无害有一个或多个限制酶切割位点，供外源基因插入能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择质粒——基因工程中常用的基因载体（课本P6）质粒是基因工程常用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子，对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。【反馈练习】质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是（）①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA⑥环状DNA⑦能“友好”地“借居”A．①③⑤⑦ B．①④⑥C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦C【反馈练习】下列关于质粒的叙述，正确的是（）A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行B题型一

限制酶及其作用特点【例1】

下列有关基因工程中限制酶的叙述,正确的是

(

)A.限制酶只能识别6个或8个脱氧核苷酸组成的序列B.限制酶的活性受温度的影响C.限制酶能识别和切割RNAD.限制酶只能从原核生物中提取解析:限制酶能够识别并切割双链DNA上特定的核苷酸序列,多数限制酶能够识别由6个核苷酸组成的序列,少数可以识别由4,5或者8个核苷酸组成的序列。限制酶的化学本质是蛋白质,活性受温度影响。限制酶主要从原核生物中获得,同时在某些真核生物(如酵母菌)细胞内也存在。答案:B题型二

DNA连接酶及其作用特点【例2】

下列有关DNA连接酶的叙述,正确的是(

)A.T4DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B.E·coliDNA连接酶能将双链DNA片