遗传学实验双周周四

OlafBergmann,1,15,*SofiaZdunek,1,15AnastasiaFelker,1MehranSalehpour,2KanarAlkass,1,3SamuelStaffanL.Sjostrom,1Miros1awaSzewczykowska,5TeresaJackowska,5,6CrisdosRemedios,7TorstenMichaelaAndra¨,9RamadanJashari,10JensR.Nyengaard,11Go¨ranPossnert,2StefanJovinge,12,13,14HenrikDruid,3andJonasFrise´2乌普大学物理与天文系，75120乌普，瑞3法医学院，瑞典卡罗林斯卡，17177斯德哥尔摩，瑞6儿科医学中心，教育中心，01-813华沙，波8小儿心脏手术中心，斯卡大学医院，22185隆德，瑞9克拉根福段外科研究，心胸血管外科，医学，9020，奥地13温安洛，大急流城,MI49503,14干细胞中心，隆德大学，22184隆德，瑞*通讯olaf.bergmann@ki.seO.Bjonas.frisen@ki.se14C一、简的概念。然而，新心肌细胞（Bersell等,2009;Ellison等,2013;Hsieh2007;Senyo2013;Uchida2013;vanBerlo2014）和细胞更新（(Bergmann2009;Hosoda2009;Kajstura2010a,2010b;Malliaras等,2013;Mollova等,2013）数据之间的却使得研究（Soonpaa，1996；沃尔什等，2010）。最近的一项研究表明，在幼年小鼠倍（Naqvi，2014）。近期显示，人类从1到20岁心肌细胞的数目可增加3.4倍（mollova等，2013），而心肌中的其他主要细胞数量的发展中并未述。每隔几年更新一次（待，BergmannandJovinge，2014）。从相当多的成质性的更新（Beltrami，2001；kajstura，2010a），但其他研究未能再现高频的潜在细胞（mollova等，2013）。无论如何，建立在存在细胞分或22%(Kajstura2010b)。另一项对新生细胞组DNA的14C分析显示(Spalding等，2005)，人类心肌细胞的更等,2009）。通过分析组14C浓度找到新生细胞，建立了一个人类心肌细胞增殖与再生的二、结（一）我们对29具没有任何病史或心脏疾病迹象、介于一个月至73岁的死亡进行了心脏体视学检查（见实验程序；图1A）。组织切片中的难以描述单个的心肌细胞（Ang等,2010)，尤其是在围产期，存在细胞密度很高的情1（PCM-1)抗体解决这个问题(Bergmann等,2011)。通过直接测量（n=12）MRI（N=17）（实验步骤；图S1D和S1E，我们得到了的参考体积20-73430000±72000（均值±SD）下降至到28000±7200个/mm3（图1A）。这项的新生儿心肌细胞密度与Mayhew(409,000/mm3Mandarim-de-Lacerda等人的(1997)研究结果一致,Mandarim-de-Lacerda574000mm3（Mayhew等,1997）。而结果所得的心肌细胞核总数没有显示出任何(Pearson’sr=0.01;p=0.96)或关联(两样本t检验;p=0.10)的差异（1B）。))（（岁（岁（（岁（岁（（岁（岁（（（岁（岁心（（A)生长中的心脏的心肌细胞核密度下降，并在衰老过程中保持不变。（B)使用参考体积计算（见实验程序）的的心肌细胞核数量出生后保持不变。（C)单肌细胞与多肌细胞的比例在出生时就已经确定（D根据心肌细胞核的数量和多核化水平显示，心肌细胞数在生长的心脏中没有显著改变，并随也无显著改变(R=0.01;p=0.96)。（E)的体积增加（黑点和黑色回归线）和心肌细胞平均体积增加（白点和虚线回归线）的对比。这两个群体的回归曲线未体现任何显著差异（p=0.67；协方差分析）。（F)人类出生时心肌细胞核大多数为二倍体，并主要在第二个十年开始发生多倍体化（100%对应二倍体核，200%对应四倍体核）。红色数据点代表女性，蓝色数据点代表样本。长虚线代表预测区间，短虚线代表置信区间。（（岁（岁（岁（)S1生长中与成年心脏的体视学与DNA含量分析，与图1相关)（A）心肌横切面的典型图像。心肌细胞的细胞核标记抗体PCM1（绿色）和心肌边界标记抗Cx43和抗肌萎缩蛋白抗体（红色）。比例尺为20μm。细胞核用DNADraq5染色可视（灰色）（BC）Mollova等人进行的(2013PCM1和小窝蛋白3（B）或心肌肌钙蛋白I（C）标记的新生儿心脏组织。没有心肌细胞核标记物（PCM1)，即使利用共聚焦显微镜（63倍物镜，zstack图像)也是很难确定心肌细胞核（箭头）和非心肌细胞（箭头所示）的。比例尺10μm。（D）幼儿心脏体积与表面积的相关性（BSA）（szewczykowska等2009）。（E）幼儿或成人离体心脏样本的体视学研究的测量（白色三角形）与估计（黑色三角形）。（F）幼年和的心肌细胞的体积增加，并在成年后保持稳定（G）心肌细胞核多倍体化的时间过程（完全对应于二倍体核，是四倍体核的2倍）。女性受试者数据点为红橙色，为蓝色。（H）心肌细胞核平均倍性水平比较（心尖与基底层，心外膜与心内膜心室区域）。可以确定无显著差异（配对t检验，分别p=0.68p=0.92）。73.6%7.0%为单核细胞，25.5%±7.4%为双核，1.0%±1.2%1C),与之前的研究结果一致（(Mollovaetal.,2013;Olivettietal.,1996）。这个比例在心脏发育及衰老过程中不会改1（最年轻的分析样本）后，心肌细胞的数量最终确定(3.23109±0.753109个）并且一生中都保持不变(Pearson’sr=0.01,p=0.961D)1-203.4(Mollovaet2013)的形成了鲜明的对比。组织切片中的心肌细胞核的鉴别十分etal.,2010;SoonpaaandField,1998)，基于胞膜或质膜的心肌细胞标记策略(Mollovaetal.,2013)不能明确的鉴别出心肌细胞核（S1B和S1），可能会引入量化偏差。而我们使用心肌细胞特异性核标记则更可能准确识别和量化心肌细胞。不同的心肌细胞平均体积（图1F；实验程序）。分别基于不同左心室与心肌细胞的相对体积(inrelationtoLVmonth0–6:12.4g±3.4gSDandCMmonth0–6:2,557mm3±666mm3SD)，我们发现的生长完全是由于心肌细胞体积的增大（ANCOVA；P0.7）（1E）。表明在围产DNA合成并成为多倍体(Adler,1991;Bergmannetal2009;Hergetetal1997;Mollovaetal2013).，但这一点周期中一直保持二倍体(Kajsturaetal.,2010b)DNA合成过程中多倍体化细胞仪重现检查了不同的人类心肌细胞核中的DNA含量。（图1F)。然而，主要在生命周期的第二个十年里，中每个心肌细胞核DNA1.7(n29;Pearson’sr0.09;p=0.68;图1F)。而相比呈现稍低倍数的增加(p<0.001;两样本t检验），101.6倍，并且终生保持不变(n=19;Pearson’sr=0.32;p=0.29;图S1G)。我们的分析表明多倍体化的发生比之前部分（配对t检验；P=0.68）或对心内膜心肌层与对心外膜心肌层的比较（配对t检验；P=0.92）中，我们没有发现内核倍体的任何显著差异（图（三）接下来，我们通过结合凝集素荆豆凝集素I(UEAI)(Conrad-Lapostolleetal.,1996)和间充质细胞，使用心肌细胞和内皮细胞标志物(PCM-1andUEAI 缺失的方法(图S2A)，对内皮细胞进行了体视学定量检测。间充质些细胞均没有心肌细胞或内皮细胞标志物(FigureS2B)。约99%的细胞在PCM-1和UEA的负部分可以被包括抗PDGFRβ抗体、成纤维细胞特异性蛋白1、平滑肌肌动蛋白的间充质细胞标志物组合标记（图S2B）。然而，2.8%的细胞在PCM-1和UEA负部分均表达了淋巴细胞共同抗原CD45（图S2C），并且其中一些CD45阳性细胞共表达出一种骨髓间充质干细胞标志物（PDGFRβ，成纤维细胞特异性蛋白1，和/或平滑肌肌动蛋白）（图2D）。然而CD45阳性细胞的测量部分长度不足以显著的解释对间充质细胞室的14C测量结果的影响（只2.814C）CD4514C图S 内皮细胞和间充质细胞的鉴定，与图2相（A）代表（A）代表代表。内皮细胞被凝集素UEAI标记（箭头），间充质干细胞（箭头）是PCM-1（红色）和UEAI（绿色）。心肌细胞被MHC标记（灰色）。（B）大部分（-99%）非心肌细胞（MHC阴性），非内皮细胞（UEAI）表达了为间充质细胞标记（箭头）的PDGFRβ，平滑肌肌动蛋白（SMA）和/或成纤维细胞特异性蛋白1（角蛋白）。星号表示心肌细胞核，箭头表示内皮细胞核。A和B比例尺20μm。（C）大约2.8%的UEAI，PCM-1阴性细胞表达出CD45（箭头）（D）一些间充质标记物的共同标记(PDGFRbeta,FSP1和SMA头）。比例尺10μm。出生后，人类细胞核主要为心肌细胞核(66%±1.7%;mean±6.58.2倍（2A2B），（（））（岁（岁18%3.0%24%4.7%，且间充58%±5.6%。在老化过程中，内皮细胞和间充质细胞计数显示出下降趋势(Pearson’sr=0.58;p（（））（岁（岁2.出生后内皮细胞和间充质细胞群的扩张（AB）内皮细胞和间充质细胞的数量在心脏生长过程中增加，此后开始下降。长虚线代表预测区间，短虚线代表置信区间。参见图S2。（四）心肌细胞核从的心脏中分离出来并与PCM-1和UEAI的抗体共同培养，再用流体细胞仪分离出心肌细胞（PCM1阳性），内皮细胞（UEAI阳性），和骨髓间充质细胞（PCM-1和UEAI细胞）的细胞核（图3，S3；实验程序）。(BergmannandJovinge,2012;Bergmannetal.,2011).。UEAI能特异性的结合人类内皮细胞，并且我们发现，UEAI不仅能与内皮细胞膜结合，也能与心脏内皮细胞核结合（3B–3F）。成年人心脏的33%±15%(mean±SD)的心肌细胞核,24%±9.5%的内皮细胞核,43%10%胞核（94%±5.4%）、和间质细胞核（97%±5.7%）的纯度（图S3A–S3C）。我们从不同细胞群中分离出组DNA，并用质谱法测定了14C浓度。并且正如实验过程中所描述的，14C3.心肌细胞、内皮细胞和间充质细胞的识别与分离（A）肌球蛋白重链（灰色）抗体识别人类心肌细胞。所有的心肌细胞核，不包括间质核，呈现PCM1免疫（箭头所示）。刻度显示10毫米。（BD）如图所示凝集素UEAI能特异性结合人类内皮细胞核。心脏组织切片的显微图像（B)显示了UEAI和内皮细胞标记物血管性血友病因子（vWF）的共标记。刻度显示20mm。心脏组织的超分辨率图像（C）和核分离株超分辨率图像（D）显示了心脏内皮细胞核和UEAI的结合（箭头）。核纤层蛋白AC（红色）标记核被膜。箭头表示非内皮细胞核。刻度显示10mm。（E和F）流式细胞仪图像（E）标记同型对照抗体，（F）共标记了含有分离心肌细胞的凝集素UEAIPCM1抗体的心肌细胞核，内皮细胞，以及间充质细胞。参见图S3年年DNA含量年gDNAS3流式细胞仪的分类策略及回顾性出生年代的验证，与图34/5相关（AC）流式细胞仪分类核的代表性再分析。（D）从整个心脏组织（红色三角形）以及未分类的心肌细胞核分离出的基因组DNA（绿色的点）的14C浓度测定值。分类心脏细胞的14C浓度总结（心肌细胞，内皮细胞，和人群间充质细胞），用它们的小尺寸和倍性（蓝钻（见实验程序）。群体观察无实质性差，表明有非常低的或非常高的更新率的细胞种群都不可能错过核和策略。（E）Bergmann等人(2009)进行的心肌肌钙蛋白（深蓝色）PCM1标记（浅蓝）的心肌细胞核的分离组DNA的14C浓度（F）流式细胞仪检测点图显示不同排序策略对应的心肌细胞核DNA含量（2n：二倍体，4n，四倍体：8n：八倍体）14C浓度。群的组DNA、未分化心脏细胞核的组DNA以及从心肌细胞中提取组DNA进行了碳定年。我们计算了各类群（心肌细胞、内皮细胞和间充质细胞）14C14C结果在这两种方法之间没有发现任何显著的差异(分别为p=0.31andp=0.76,，配对t检验，），14C分布（图S3D）。(Bergmann14C,2009)和PCM-1标记(Bergmannetal.,2011)对得到的组14C的浓度无影响（中位数检验P＞0.0590%；图S3E；参见补充实验步骤）（五）我们从20-74岁样本的内皮细胞（n=16)和间充质细胞(n=26)的组DNA14C14C（4A；S1和S2）。内皮细胞的组14C浓度水平与当代水平非常接近，且差异低，显示出内皮细胞的更新率高且与无关。间充质细胞的14C值普遍较高且呈。曲线模式，且更新较慢（图4B和4C）内皮细 间充质细。年年内皮细年年内皮细内皮细年间充质间充质细（岁（岁（岁（）%（A14C数据示意图。黑色曲线代表大气14C浓度随时间的变化。彩色点代表在曲线峰前（绿色）后（橙色），按出生日期标注（垂直线）的基因组14C浓度。组14C值对应出生时的14C浓度，表明出生或成年均无细胞更新。14C曲线的偏差表明出生后和成年人的组DNA更新。所有中样本的时间均在2002-2014年之间。（B）分离的内皮细胞的组14C浓度与样本的无关，且对应的内皮胞的约为5.8岁。（C)分离的间充质细胞的组14C浓度表明成年人的间充质细胞平均17.3年更新完全更新一次。（D）内皮细胞和间充质细胞的年增殖率在生长的心脏中呈指数下降。在成年人心脏中间充质细胞增殖率下降至低于4%，然而内皮细胞的年增殖率为17%并维持恒定。（E和F）在一个人的一生中的不同阶段，后天产生的细胞以深浅不同的灰色表示，表明它们出生于不同时间。黑色表明细胞是出生之前产生的；暗灰色表示细胞在第一个十年出生；次暗灰色表明细胞出生于第二个十年，以此类推。（E）据此，所有内皮细胞的90%将在十年内被迅速取代。（F）骨髓间充质细胞表现出较缓慢的更新，且存在介于中年和老年之间的几乎所有阶层的细胞表达。内皮细胞和间充质细胞的更新率分别基于相和三相的模型。参见图S3和表S1S2。14C型。我们的数学模型以层定义细胞，当衰老时，细胞也在衰老，使它们从一个阶层进入另一个阶层（传输方程），方程的解n(t,a)即为细胞的分布，并且可以选择任意时间点进行计算，例如一个的时间。n在下面的方程中代表细胞密度（n的积分是细胞数）。ta分别代表样本和细胞。方程解整合了曲线和细胞群生成的14C浓度，相当于测量的14C浓度。模型拟合了会对测量细胞数和14C浓度造成影响的细胞出生率与率。在上面的方程式中，g代表率，出生率则在伴随条件中作为附加方程（补充实验程序给出的方程）。出生和率的函数形式构成了几个版本的描述模在和成年早期，内皮细胞和间充质细胞会经历一个成长期（A)，随后在成年期略有下降（B)（2A2B）。因此，我们构建了一个包含几个偏A、B两个阶段我们对出生率和率都进行了调整，以便更好的拟合细胞数的变化。我们首先拟合了内皮细胞和间充质细胞的生长期后率维持恒定的情况，内皮细胞的拟合结果很好，并显示在生长期后的拟合结果与无关，表明该方案是适123.0%，成年期16.7%并维持恒定（4D）。而新生间充质细胞显示更新速23.5%3.9%（4D）20-75岁9次（4E），而间充质细胞则将在生长期后更新两次（4F)。（六）51个8-75岁之间受试者的心肌细胞核样本的组14C浓度（表S1和S2）与大气的14C曲线进行了对比，发现在中，对心内膜心肌层和对心外膜心肌层的肌细胞(配对t检验;p=0.32)（图5A），或在的心尖部或基底部之间的肌细胞(配对t检验;p=0.80)(图5B)的组14C浓度没有显著差异。这四个区域的14C浓度显示出一个共同的趋势，之后出生的14C14CDNA更新的是有限的。异。因此，我们整合了所有从不同区域测量的14C值（n=32）并与右心室的组14C浓度进行了对比（图5C）。的组14C数据是心肌细胞DNA的镜像模式，之后出生的受试者几年内的14C浓度与大气14C14C（3F）。大多数数据对应受试者出生后的大气14C浓度，表明出生肌细胞进行了更新（图5D）。上皮上皮细内皮细心心基年年双年年5.心肌细胞14C测年的回顾（A-D）人类心脏心肌细胞的14C浓度（A-C）。核试验后出生样本的14C浓度与出生后数据相吻合，表明出生后的DNA合成。大多数出生在 曲线峰或之前的样本的14C浓度有所升高，表明包括成年人在内存在DNA更新。（A到C）心外膜心肌层和心内膜心肌层心肌细胞的组14C浓度比（A），心尖部和基底部心肌细胞的组14C浓度比较（B），以（一些14C数据已经被Bergmann等在2009年报告；图S3E）和右心室（C）心肌细胞的组14C浓度比较，均未发现显著的种群间的差异（见果）。大部分数据与出生的14C浓度不符，表明出生后和成年人DNA的更新是有限的。（D）二倍体心肌细胞核的组14C浓度表明心肌细胞的更新。参图S3和表S1和S2。（七）人类心脏心肌细胞的与更新我们应用上述的数学模型对心肌细胞的14C数据进行了分析，与体视学数据相符，14C的数据与出生肌细胞的大幅增长不兼容（见补充实验步骤；对心脏生长过程的心肌细胞数量扩张的14C模拟）。心肌细胞数量恒定的数学建模方14Ca2.3倍（图S4）年S4心肌细胞数量增加的14C值数学模型，与图6相关。由于多倍体化和细胞更新，出生肌细胞DNA的合成大多发生二十年（图6A）。数学模型显示出生后心肌细胞的更新率在第一个十年内最高，200.85，750.3%（6B；补充实验异随增长而增加（图6C）。大部分心肌细胞在围产期已经形成，并且约80%的心肌细胞在10岁之后即使在漫长的生命中也将不再更新。75岁的一生中，39的心肌细胞在出生后就已经形成，并且其中的36是十年形成的（图6）。到75岁为止细胞的50.4被更新，而的心肌细胞更新率没有显著差异（p005，见补充实验程序）。全DNA合（）（）%%（%%）（岁 （岁 （））（岁 （岁6.人类心脏心肌细胞的更新动力学（A)从与指示的多倍体化（图案填充）相关的不同的心肌细胞组14C浓度（黑）推断的全面的DNA合成。（B)在生长中和成年人的心脏中，心肌细胞的年出生率呈指数型下降。20岁的心肌细胞更新率为0.8%，在老年样本中则下降至低于0.3%。（C)成年后出生的心肌细胞在25/5075岁的年龄分布。（D)心肌细胞总数在出生时就已经确定并终生保持恒定。类似于图4在一个的一生中的不同阶段，出生后产生的心肌细胞以深浅不同的灰色表示，表明它们出生于不同的时期。的一生中，约35%的心肌细胞是出生后更新产生的，大部分的心肌细胞则都是在出生前或出生后第一个十年产生的。心肌细胞的更新基于累计生存模型。参见图S4和表S3。三、讨14C（一）（二）细胞周期(Walsh等,2010)。而人类的大部分心肌细胞在整个生命周期中都保持单核状态（1C）。与之前的研究(Adler1991;Mayhewetal1997)相一致的，基于我们的体视学定量研究（1A-1D）14C（图S4），但不排除近年Mollova等人(2013)心肌细胞数量增加数倍的可能性。75岁间产生的心肌细胞，36%10岁之前产生的（6C6D）。在生命周期的第二加的DNA含量在20岁时也达到成人水平（图1），表明胞质和多倍体化（三）大多数心肌细胞不更对于成人心脏的细胞可塑性一直存在很大的争议。对组14C浓度的分析揭示了成人的心肌细胞平均比小5岁，并且在漫长的一生中只39%14C率的评估，不需要考虑多倍体化因素的影响，预计75岁的一生中更新率达殖率的结果(Mollovaetal.,2013)相一致。心肌细胞的产生表现为不增加细胞数(Naqvietal2014)0%-4.0%的更新率在大多数报告的啮齿类动物的更新率范围内(Malliarasetal.,2013;Senyoetal.,2013;SoonpaaandField,1997;Walshetal.,2010)。（四）(Caietal.,2008)。我们后可以被胸腺素b4重新激活，胸腺素b4是一种与心脏的生成和发展相关的肌动蛋白单体结合蛋白(Smartetal.,2011)。然而，我们无法检测到对心外膜心肌是在心尖区的干细胞且血流动力学负荷更低(Beltramietal.,2003)。最后，露于本质上不同的工作负荷。尽管每个核的DNA平均含量显著高于右四、实验程（一）14C1和荆豆凝集素的抗体染色并利用DNA，并如在补充实验程序中描述的测量14C（二）4mm）8%5-6mm40mm的切片并染色，进行立体计量学分析（见分段免疫组化）。分析仪器为LSM700共聚焦显微镜（633403计划载油目标），并使用ZEN2010b软件的newCAST模块(v.4)(VisiopharmA/S).200个细胞（1%-7622mm，40×4020mm，3mm保护区)。为了确定心肌细胞的向轴线被切割。使用缝隙连接蛋白-43标记心肌细胞的边界，(兔抗缝隙连接-43蛋白1:5000SigmaAldrich;钙粘蛋白[幼体鼠抗钙粘蛋白1:200Abcam]),抗肌萎缩蛋白（兔抗肌营养不良蛋白，1:2000，AtlasAntibodies），PCM-1标记凝集素I（UEAI）与异硫酸荧光素结合鉴定内皮细胞(VectorLabs),。无PCM-1和UEAI的为间充质细胞。为了估计心脏内的细胞总数，我们使用了NV3VREF方法（NV为估计密度数值，VREF为目标组织或区域的参考体积）(Bru¨elandNyengaard,2005）。通过心肌细胞密度1.06g/cm3的湿心室计算参考体积(Bru¨elandNyengaard,2005)。医方整个S1B）。必要时，可纠正沿z轴的组织收缩。未观察到组织沿xy轴的收0.2（20%）。五、其（一）获得。（二）O.BS.Z.,和J.F.构思并设计了实验。O.B.,S.ZA.FK.A.,S.L.S.了实验并分析。M.Salehpour和G.P.进行了质谱（AMS）测量和分析S.Z.和S.B.K.A.,M.AR.J.,CRT.MS.J.,H.D.提供了组织样本和资料。M.Szewczykowska和T.J.提供并解释了儿科超声心动图资料。O.B.,S.Z.,和J.F.写著手稿。六、致感谢WethankG.Eppens,J.Panula,andE.Norlin帮助用流式细胞仪分类和纯化DNA，M.ToroandS.Giatrellis使用流式细胞仪的辅助和建议，以及K.Ha°kanssonAMS的样品。我们 的研究计划（stratregen）、TorstenSoderbergsStifse,、KnutochAliceWallenbergsStifse，以及李察和海伦狄维士资助的。随机几何学中心和收到：2015114修订：2015318接受：2015422：2015611参考文[1].Adler,C.P.(1991).Thedevelopmentandregenerativepotentialofcardiacmuscle.InTheDevelopmentandRegenerativePotentialofCardiacMuscle,J.O.Oberpriller,J.C.Oberpriller,andA.Mauro,eds.(London:HAP),pp.227–252.[2].Ang,K.L.,Shenje,L.T.,Reuter,S.,Soonpaa,M.H.,Rubart,M.,Field,L.J.,andGalin˜anes,M.(2010).Limitationsofconventionalapproachestoidentifymyocytenucleiinhistologicsectionsoftheheart.Am.J.Physiol.CellPhysiol.298,C1603–C1609.[3]. 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