纯培养和显微技术

纯培养和显微技术第一页，共四十七页，2022年，8月28日目的和要求：本章主要使大家熟练掌握无菌技术、纯种分离技术，并对显微镜的结构、种类、原理和显微观察技术有初步了解

重点、难点：（1）微生物学实验操作的最基本的无菌技术（2）掌握微生物的分离、纯化及纯培养技术。（3）熟练使用普通光学显微镜，理解提高光学显微镜分辨率的原理。 第二页，共四十七页，2022年，8月28日第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术用于分离、转接、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在分离、转接、培养微生物做到无菌操作在分离、转接、纯种培养过程中为保持纯种的“纯洁”性而防止被其它微生物污染的技术。 第三页，共四十七页，2022年，8月28日高温干热灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：1、微生物培养的常用器具及接种室的灭菌（1）常用的器具：第四页，共四十七页，2022年，8月28日紫外线杀菌效率与照射强度和时间的成积成正比化学消毒剂熏蒸灭菌霉菌较多先用5%石碳酸喷洒，再用甲醛熏蒸细菌较多乳酸和甲醛交替熏蒸超净工作台的灭菌 （2）接种室的空气灭菌第五页，共四十七页，2022年，8月28日2、接种操作无菌操作：培养基经过高压蒸汽灭菌后，用无菌工具在无菌条件下将含菌材料移接于培养基的这一过程。火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行第六页，共四十七页，2022年，8月28日无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行第七页，共四十七页，2022年，8月28日微生物的纯种分离：从多种混杂的微生物中，经某种技术或方法获得单一菌株的过程。微生物的纯培养物（pureculture)：一株菌种或一个培养物中的所有细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代

二、微生物的分离纯培养技术第八页，共四十七页，2022年，8月28日纯种分离的原理和方法第九页，共四十七页，2022年，8月28日1.用固体培养基分离纯培养法原理：使微生物稀释后在固体培养基平板上形成单个菌落方法：稀释倒平板法涂布平板法平板划线法厌氧微生物的固体平板分离法 第十页，共四十七页，2022年，8月28日1、稀释倒平板法2、涂布平板法对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！第十一页，共四十七页，2022年，8月28日第十二页，共四十七页，2022年，8月28日3、平板划线法方法：平行划线法之字形划线法

第十三页，共四十七页，2022年，8月28日第十四页，共四十七页，2022年，8月28日4、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧手套箱对严格厌氧微生物的培养采用稀释摇管法进行分离第十五页，共四十七页，2022年，8月28日个别细胞较大细菌固体平板不能长菌落原生动物、藻类接种物用液体培养基顺序梯度稀释法分离:

2、用液体培养基分离纯培养 第十六页，共四十七页，2022年，8月28日培养物在液体培养基中进行顺序梯度稀释，使每一稀释度都含有很多平行试管，如果同一个稀释度的大多数（一般应超过95%）平行试管中没有微生物生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。 第十七页，共四十七页，2022年，8月28日3、单细胞（孢子）分离法一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比；解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子） 第十八页，共四十七页，2022年，8月28日4、选择培养分离法抑制大多数其它非目的微生物；使待分离的目的微生物成为优势菌；原理：创造适于目的微生物生长条件；第十九页，共四十七页，2022年，8月28日方法：1、利用选择培养基直接分离目的微生物2.富集培养第二十页，共四十七页，2022年，8月28日1、利用选择培养基直接分离目的微生物抑制性选择培养基（selectivemedium）:根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计，只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基。

第二十一页，共四十七页，2022年，8月28日例一：从土壤中分离筛选蛋白酶产生细菌 第二十二页，共四十七页，2022年，8月28日含牛奶选择培养基目的菌的平板第二十三页，共四十七页，2022年，8月28日例二：从土壤中分离筛选产高温淀粉酶（65℃）细菌 第二十四页，共四十七页，2022年，8月28日2.富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物特定的条件使目的微生物旺盛生长待分离微生物在群体中成为优势菌第二十五页，共四十七页，2022年，8月28日富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术手段之一。根据微生物的特殊要求，从自然界分离出各类特异的微生物；例：从土壤中分离能降解利用对羟基苯甲酸的细菌 第二十六页，共四十七页，2022年，8月28日5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。病毒和宿主细胞；第二十七页，共四十七页，2022年，8月28日菌落（colony）：

单个（或一团相同）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体众多菌落连成一片菌苔（lawn）第二节微生物观察技术1.微生物群体肉眼观察第二十八页，共四十七页，2022年，8月28日不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。第二十九页，共四十七页，2022年，8月28日第三十页，共四十七页，2022年，8月28日同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落第三十一页，共四十七页，2022年，8月28日2、显微镜个体观察技术放大倍数分辨率反差能辨别两点之间最小距离的能力被观察物区别于背景的程度一、显微技术：用显微镜进行观察的技术显微镜的自身特点有关也取决于显微观察时对显微镜的正确使用良好的标本制作和观察技术评价显微镜性能的指标第三十二页，共四十七页，2022年，8月28日二、光学显微镜的种类及原理1.普通光学显微镜第三十三页，共四十七页，2022年，8月28日光学显微镜的一般配置如何实现光学显微镜一般配置的最佳观察效果？目镜：10~15╳；物镜：100╳；总放大倍数1000~1500╳；第三十四页，共四十七页，2022年，8月28日l分辨率（最小可分辨距离）=————

2nsinqλ：可见光波长n：玻片与物镜间介质的折射率θ：物镜镜口角的半数nsinθ：物镜的数值口径值 第三十五页，共四十七页，2022年，8月28日提高普通光学显微镜分辨率的技术措施：

使用波长较短的可见光（450nm的蓝光）；使用油浸物镜增大反差（色差）的技术措施：

对微生物细胞或特殊结构染色 第三十六页，共四十七页，2022年，8月28日2、特殊的光学显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜 第三十七页，共四十七页，2022年，8月28日相差显微镜的原理：当光线通过透明的活细胞时，由于细胞内各部分结构密度的差异（或折射率的不同)，而使光波的相位发生变化，形成相位差，但人的眼睛分辨不出相位差异，相差显微镜就是根据光波干涉利用特殊的环状光阑和相差板将相位差转变为振幅差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。用途：活细胞运动情况和微细结构的观察第三十八页，共四十七页，2022年，8月28日暗视野显微镜原理：聚光系统加以改造，实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后在进入物镜，所以样品是一个暗背景下显现亮的物象。暗视野显微镜的分辨率很高荧光显微镜的原理：在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体第三十九页，共四十七页，2022年，8月28日第四十页，共四十七页，2022年，8月28日光学显微镜的特性第四十一页，共四十七页，2022年，8月28日二、电子显微镜的种类及原理1、透射电镜（transmissionelectronmicroscope,TEM） 电磁波作“光源”高速电子透射样品，电子束通过电磁场产生偏转、汇集或发散等复杂的螺旋式运动，聚集成像，用荧光屏或感光胶片做记录。电磁波波长短，分辨率高：光学显微镜μm级，电镜nm级。

第四十二页，共四十七页，2022年，8月28日2、扫描电镜（scanningelectronmicroscope,SEM）

电子束做电子探针在样品表面扫描时激发出二次电子，二次电子产生的多少与样品表面立体形貌有关。对二次电子处理，在荧光屏呈现放大样品表面立体图像。 第四十三页，共四十七页，2022年，8月28日第四十四页，共四十七页，2022年，8月28日3、扫描隧道显微镜原理：当金属探针可以接触到样品表面的电子云时，在探针和样品之间加零点几伏的电压将有隧道电流产生，该电流对针尖及样品间的距离非常敏感，保持探针扫描样品时的电压和高度恒定，通过记录电压或电流的变化了解样品的表面形貌。4、原子力显微镜用激光装置监测探针随样品表面的升降变化来获