临床微生物实验室细菌鉴定指南(上)

..临床微生物实验室细菌鉴定指南上间来源温一．细菌的鉴定步骤．鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程．对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好有单个菌落可以进行生化试验。（我们这里一般都是预先纯化培养）．对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c，G–b，Gc，+b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。4．按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血5．复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透.

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...性）。第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）第三步：用95%乙醇脱色（染色液Ⅲ）第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）⑵．触酶实验(HO22

实验)：原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧继而形成氧分子出现气泡。方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。阳性对照用金黄色葡萄球菌阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性链球菌属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属+），微球菌属（+），链球菌属（－）。.

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...⑶．氧化酶实验（Kovac验）：

原理：氧化酶又称细胞色素酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶酶并不直接与试剂（1%酸四甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化出现深兰色反应。方法（滤纸法，菌落法，试剂纸片法）：一般我们采用滤纸法，取白色洁净滤纸条，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而出现深兰色结果读取秒钟时为最佳秒内读取可靠。本实验避免接触含铁物质（假阳性），也不能在含糖培养基上生长的菌落进行实验（假阴性）。阳性对照用铜绿假单胞菌，阴性对照用大肠埃希菌。应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区别假单胞菌属和肠杆菌，前者阳性，后者阴性。二．葡萄球菌属的鉴定葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。．形态与染色：葡萄球菌直径0.5～1.5μm，菌体圆形，呈单个，成双以及不规簇状排列。染色呈紫色，为革兰阳性球菌。．与链球菌的区别：触酶实验为阳性，而链球菌阴性菌体形态链球菌小于葡萄.

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...球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌3．与微球菌的区别触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验（操作方法同甘露醇试验）为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外呋喃唑酮即痢特灵50μg/片）敏感实验微球菌为耐药，而金黄色葡萄球菌为敏感。4．葡萄球菌属的种间鉴定：⑴．菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落大多数为白色也有部分为柠檬色或深黄色。⑵．溶血毒素：金黄色葡萄球菌有αβ﹑γδ溶血毒素，各毒素的区别是对动物红细胞的溶血范围﹑抗原性及溶血时的温度等其中以α溶血毒素为主而其他葡萄球菌大多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。⑶．血浆凝固酶实验：用与区别金黄色葡萄球菌阳性），表皮葡萄球菌（阴性），腐生葡萄球菌（阴性）。血浆凝固酶是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝固酶两种。血浆凝固酶检测有两种方法为玻片法和试管法，我们一般采用玻片法。a.操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血浆乳化，结合凝酶能作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在金黄色葡萄球菌表面发生凝集，所以我们肉眼能看见凝集颗粒。玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金.

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...黄色葡萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反应因子（类似凝血酶的一种物质）作用，形成复合物再使纤维蛋白原转化成纤维蛋白而发生凝集试管法主要由游离凝固酶作用产生。b.注意事项：菌落不能太多，否则会影响结果观察；凝固酶阳性要做自凝阴性对照（用生理盐水代替血浆），只有在阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳性，有一部分葡萄球菌有自凝现象。⑷．新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌对新生霉素纸片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则对之耐药抑菌环直径>16mm为新生霉素敏感。⑸．甘露醇氧化发酵实验：a.操作方法：取两支甘露醇微量生化管在微量管内接种待检细菌，然后一支加两滴石腊密封，另外一支则不加放37℃孵箱内18～24h后观察结果b.结果观察：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露醇若两管都变黄色则说明是发酵型；其中加石蜡管不变色没加石蜡管变黄色则为氧化型；如果两管都不变色则说明该细菌是不利用甘露醇产碱型）。c.应用：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇（即两管都变黄色）；表皮葡萄球菌需氧部分产酸，厌氧条件下不利用甘露醇（即没加石蜡管有部分会变黄色，加石蜡管不变黄色；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类.

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...似。三．微球菌属的种间鉴定微球菌属主要的种有易变微球菌，藤黄微球菌玫瑰微球菌。鉴定生化见下表微球菌属的种间鉴定色素产生

易变微球菌黄色

藤黄微球菌黄色

玫瑰微球菌粉红色需氧葡萄糖＋

＋－产酸硝酸盐还原脲素酶

＋d

－d

－＋氧化酶－

＋－/（弱）新生霉素敏S/R

SR感d：不定

S：感

R：耐药.

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...四．链球菌属1．形态和染色链球菌的直径为0.5～1.0μm，呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛，没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜。肺炎链球菌呈矛头状，宽端相对，尖端向外。2．根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：⑴甲型（α-）溶血，即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环；⑵乙型（β）溶血，即菌落周围出现较宽的透明溶血环；⑶丙型（γ-）溶血，即菌落周围无溶血环。3．根据抗原结构C多糖抗原）的不同可分为A﹑B﹑CD﹑EF﹑G﹑H﹑KL﹑M﹑N﹑P﹑Q﹑﹑18个群对人类有致病者90%于A群，偶见其他群链球菌致病。4．链球菌属的种间鉴定⑴．乙型溶血链球菌的鉴定：．对杆菌肽（0.04U/）（抑菌圈直径≥10mm）敏感：A链球菌（主要为化脓性链球菌）。．对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，但马尿酸钠水解实验﹑CAMP验阳性：B群链球菌（主要为无乳链球菌。．对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，马尿酸钠水解实验阴性，验阴性：主要为马链球菌﹑类马链球菌﹑兽疫链球菌；对三者的区别实验要加做.

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...海藻糖和山梨醇实验。d．CAMP实验：将能产生β-溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种，再将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌3mm垂直种一短线，若在有2条下培养5～6小时，或无CO2

条件下培养18～24小时，在两细菌连接处出现一个半月型的加强溶血区即为CAMP实验阳性⑵．甲型溶血链球菌的鉴定：a．草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣（Optochin）不敏感，胆汁溶菌实验阴性，胆汁七叶苷实验阴性，在高盐中不生长主要有变异链球菌，轻型链球菌，血链球菌，唾液链球菌等。b．肺炎链球菌菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌，其他链球菌略大；在血平板上菌落细小﹑圆形﹑表面光滑﹑灰白色﹑半透明，开始时菌落呈扁平状，以后中心塌陷呈脐窝状。与草绿色链球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性，对奥普托欣（Optochin）敏感。奥普托欣（Optochin）含量为5μg/片，抑菌环>18mm敏感，<15mm为不敏感，15～18mm重复实验。⑶．肠球菌（D链球菌）的鉴定：溶血不定，主要是α-﹑γ-溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性；若能的心浸肉汤中生长即群肠球菌，不能生长.

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...为D非肠球菌。⑷．链球菌属鉴定的系统生化结果判断．1%美兰牛乳．胆汁七叶苷实验：变黑为阳性。．PH9.6肉汤实验浑浊为能在碱性环境中生长（阳性）。．6.5%NaCl心浸液肉汤由紫变黄为能在高盐环境中生长（阳性）。．精氨酸双水解酶实验：变红色（对照不变色，仍为黄色）为阳性。临床微生物实验室细菌鉴定指南下间来源温⑴

五．奈瑟氏菌属和布兰汉菌属奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌布兰汉氏菌属只有卡他布兰汉氏菌。两者系需氧革兰阴性球菌。奈瑟氏菌的生物学特性革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形无动力，氧化酶及触酶均阳性。培养时对营养要求高能在巧克力平板或有丰富营养的血.

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.22..平板上，在5～10%CO环境中生长。⑵．鉴定过程：．DNA酶实验性为布兰汉氏菌阴性则为奈瑟氏菌。．能在普通血平板上生长的为其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。．能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌。⑶．几种主要细菌对葡萄糖﹑麦芽糖﹑蔗糖的氧化分解产酸结果如下：氧化分解产酸菌种淋病奈瑟氏菌

葡萄糖＋

麦芽糖－

蔗糖－脑膜炎奈瑟氏＋

＋－菌粘液奈瑟氏菌卡他布兰汉菌

＋－

＋－

＋－⑷DNA酶实验.

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...．方法：将待鉴定细菌点种于含0.2%DNA的DNA脂平板上，培养后用1mmol/LHCl覆盖平板，菌落周围出现透明环者为阳性．原理：某些细菌能产生DNA酶可使长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链；长链DNA可被酸沉淀而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸，故在琼脂平板加盐酸可在菌落周围形成透明的溶血环。（肠杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生DNA酶阳性球菌中只有金葡菌能产生DNA酶）六．肠杆菌科肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌其中对人致病性较强的鼠疫耶尔森菌（现已基本没有流行和伤寒沙门菌；4类常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希氏菌﹑志贺氏菌﹑沙门氏菌﹑耶尔森氏菌和8种常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属﹑克雷伯菌属﹑肠杆菌属﹑多源菌属﹑沙雷菌属﹑变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属）另外还有很多细菌是肠道的正常菌群，但在一定条件下也可致病（条件致病菌）。实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验阴性为肠杆菌科细菌；阳性的为非发酵菌（我们实验室还没有简单的系统鉴定方法，一般要仪器上卡检测）或弧菌科细菌。.

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...1．肠杆菌科的系统生化⑴．KIA验（克氏双糖铁）组成：乳糖／葡萄糖=10／1（斜面／高层，其长度最好是都是2CM）结果判断：斜面或高层变黄色：阳性；不变色（红色）：阴性高层中出现裂隙产气阳性高层中出现黑色FeS：产HS阳性2⑵．苯丙氨酸脱羧酶试验细菌产生的苯丙氨酸脱羧酶使苯丙氨酸氧化脱羧后生成苯丙酮酸再与10%的FeCl

3

试剂产成深绿色反应（变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属为阳性其他为阴性）⑶．枸橼酸盐试验（碳源利用实验）在枸橼酸盐培养基中细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐分解后生成碳酸钠，使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深兰色即为枸橼酸盐试验阳性。（埃希氏菌属，志贺氏菌属，爱德华菌属为阴性，其他为阳性）注意：接种时不能被糖，蛋白胨污染，要单独接种）⑷．甲基红（MR）试验.

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...细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培养基的下降至以下时加入甲基红指示剂由桔黄色变桔红色为弱阳性；变红色为阳性。培养基成分：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红0.1g酒精300ml，水200ml主要用于大肠埃希菌（＋）和产气肠杆菌－）的鉴别；常与V-P实验联合使用，一般情况下两者结果正好相反，但也有例外如奇变两者同为阳性。⑸．MIU（动力－靛基质－尿素）试验．动力：在半固体培养基中穿刺接种细菌培养后若穿刺线周围有细菌扩散生长，则为动力（＋）；清晰则为动力（－）。．靛基质试验（吲哚试验）：某些细菌有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸生成吲哚。吲哚再与试剂对位二氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而呈红色③．尿素试验：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱，再使培养基中的指示剂（0.4%红）变红色即为阳性。⑹．硝酸盐还原试验NO

3

）NO

3

4

.

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...NO

3

2

（沙雷氏菌属试剂甲：对氨基苯磺酸试剂乙：α萘胺观察结果时甲液和乙液要等量加入，立即或10min内出现红色为阳性若不变色，则要加入锌粉：①变红色，说明硝还试验为真阴性仍不变色，说明硝还试验真阳性，但原先还原产物不是NO2阴性结果出现时有三种可能：①细菌不能还原硝酸盐亚硝酸盐继续分解生成氨或氮③培养基不适合细菌生长肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐⑺．氨基酸脱羧试验细菌产生脱羧酶分解氨基酸使其脱羧生成胺和，虽然各种细菌所产生的脱羧2酶不一定相同，但最后都能生成胺赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和CO2

。然后胺能使培养基变碱性，通过指示剂溴甲酚紫）由黄变紫即为阳性。对照管（无氨基酸）为黄色。注意：①微量管接种好后要加石蜡使培养基造成厌氧环境。（生成的胺更稳定，还能诱导氨基酸脱羧酶的产生）②对照管如果不显黄色，则结果不能判断.

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...应用：除伤寒沙门氏菌鸡沙门氏菌外，其他沙门氏菌鸟赖AA为阳性；除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌也菌为阳性⑻．葡萄糖酸盐试验微量管在培养～24h后，加班氏试剂水浴煮沸10min由兰色变黄绿色到砖红色即为阳性，不变为阴性。1．肠杆菌的鉴定流程⑴．根据苯丙氨酸脱羧酶实验：（＋）：变形杆菌属，普罗威登斯菌属，摩根氏菌属－）：埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，枸橼酸杆菌属，德华菌属；克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属。⑵．苯丙氨酸脱羧酶实验阴性，加做葡萄糖酸盐实验（＋）：克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属a．动力（－）：克雷伯菌属，属内种的鉴定主要根据吲哚试验（肺克吲哚实验阴性，三个亚种鉴别试验IMViC：肺炎－－＋＋，臭鼻－＋－d，鼻硬结－＋－－）.

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...b．动（＋），DNA酶（＋）：沙雷氏菌属动力（＋），DNA酶－），枸橼酸盐（＋）：肠杆菌属（主要是阴沟肠杆菌和产气肠杆菌，前者赖氨酸阴性而后中为阳性）动力（＋），DNA酶－），枸橼酸盐（－）：哈夫尼亚菌属（－）：加做IMViC（靛基质-甲基红-VP-枸橼酸盐试验a．IMViC（＋－－）：大肠埃希菌（HS）或爱德华菌属（HS＋）。22b．IMViC／＋－＋）：枸橼酸杆菌属⑶．苯丙氨酸脱羧酶实验阳性，根据产HS可分2（＋）：变形杆菌属属内主要鉴定试验如下尿素酶鸟氨酸靛基质麦芽糖木糖

普变＋－＋－＋

奇变＋＋－－＋

产粘变＋－－＋－

潘尼氏＋－－＋＋.

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...（－）：普罗威登氏菌属，摩根氏菌属普罗威登氏菌属鸟氨酸：－；枸橼酸盐：＋（属内鉴定尿素酶及一些碳水化合物的产酸试验，如甘露醇﹑阿拉伯糖﹑海藻糖等）摩根氏菌属：鸟氨酸＋；枸橼酸盐：－（只有一个种：摩氏摩根氏菌）⑷．志贺氏菌属和沙门氏菌属这两种菌属在肠道选择性培养基、麦康凯形成不发酵乳糖的透明或半透明的无色菌落，但一些沙门氏能产2

S就会形成中心黑色的菌落鉴定时在选择性培养基上挑选可疑菌落进行鉴定a．志贺氏菌属主要系统生化：KIAK/A只有福氏6能产气），HS（－）；：－2+/-－；苯丙：－；枸橼酸盐：－。报告结果时要根据其血清学的结果鉴定到种即A（痢疾志贺氏菌）﹑B群（福氏志贺氏菌）﹑C（鲍氏志贺氏菌）﹑群（宋氏志贺氏菌）；我国主要以B群和D为主。.

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...b．沙门氏菌属主要系统生化：KIAK/AGH（+/－）；：＋－－；苯丙：－；枸橼2酸盐：－。伤寒沙门氏菌的抗原结构：菌体抗原（O抗原），毛抗原（H抗原），包膜抗原（主要是Vi原）根据系统生化鉴定到沙门氏菌属后，在根据其抗原结构的特点用血清学凝集分到种即可报告结果。血清凝集步骤如下：A-F价O（＋）：O，Ha（＋）：A甲型副伤寒沙门氏菌）2O，Hb（＋）：B群乙型副伤寒沙门氏菌）4O，，Vi（＋）：群（丙型副伤寒沙门氏菌）67O，，Vi（＋）：群伤寒沙门氏菌）9O，Heh（＋）E3O，Hi（＋）：FA-F价（－），做Vi血清子凝集：（＋）浓菌液沸水煮沸30min