小鼠脊髓微血管周细胞的培养分离及功能评价,细胞生物学论文

小鼠脊髓微血管周细胞的培养分离及功能评价,细胞生物学论文脊髓微血管周细胞〔spinalcordmicrovascularpericytes,SCMP〕是血-脊髓屏障〔blood-spinalcordbarrier,BSCB〕的重要组成部分，介入调节脊髓微循环血流、内皮细胞严密连接和BSCB的功能。研究表示清楚SCMP的功能变化与多种脊髓疾病相关[1].既往关于中枢神经系统周细胞的体外研究多来源于脑组织，分离策略通常是使用酶消化法获得微血管片段，在血管片段的基础上分离培养周细胞，但是此策略容易造成杂细胞的污染。而用免疫磁珠分选和流式分选等方式方法处理的细胞活性差、产量低，而且成本过高。本研究基于本单位分离脑微血管周细胞的经历体验[2],使用商品化的周细胞培养基，通过培养基挑选法分离小鼠脊髓微血管周细胞，并对所获得的周细胞的功能进行评价。1材料与方式方法1.1材料1.1.1实验动物和细胞：清洁级3周龄雄性C57BL/6小鼠[中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号SCXK〔京〕2018-0007].所有的实验方案已获得中国医学科院微循环研究实验动物伦理委员会批准。脊髓微血管内皮细胞〔spinalcordmi-crovascularendothelialcells,SCMECs〕来自本实验室[3].1.1.2主要试剂：胎牛血清〔FBS〕、改进杜氏伊格尔培养基〔DulbeccosmodifiedEaglemedium,DMEM〕〔高糖〕、II型胶原蛋白酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和1PBS、0.05%胰蛋白酶和含10%FBS的DMEM培养基〔北京协和医学院细胞中心〕;含10%FBS的内皮细胞培养基〔endothelialcellme-dium,ECM〕和含2%FBS周细胞培养基〔pericytescellmedium,PCM〕〔ScienCell公司〕;牛血清白蛋白〔BSA〕〔Amresco公司〕;DNA酶I〔DNaseⅠ〕和纤维连接蛋白Fibronectin〔Sigma公司〕,胶原蛋白酶/分散酶〔Roche公司〕;抗vonWillebrandfactor〔vWF〕抗体〔SantaCruz公司〕;抗血小板源生长因子受体〔PDGFR〕、神经元-胶质抗原2〔neuron-gliaantigen2,NG2〕抗体、vonWillebrand因子〔vonWill-ebrandfactor,vWF〕抗体、胶质纤维酸性蛋白〔glialfibrillaryacidicprotein,GFAP〕抗体和-SMA抗体〔Abcam公司〕;FITC标记和TRITC标记的二抗〔北京中衫金桥生物技术有限公司〕.APC标记抗小鼠CD45抗体、PE标记抗小鼠PDGFR/CD140b抗体、PE/Cy7标记抗小鼠CD31抗体、FITC标记抗小鼠CD11b抗体及相应的同型对照〔Biolegend公司〕eFluor660标记抗小鼠GFAP抗体及相应的同型对照抗体、流式染色缓冲液〔flowcytometrystainingbuffer,FCSBuffer〕、细胞内固定工作液〔intracellularfixationbuffer,ICBuffer〕和透化工作液〔permeabili-zationbuffer〕〔eBioscience公司〕;基质胶〔BD公司〕;活细胞荧光示踪剂DiI〔红色〕和DiO〔绿色〕〔LifeTechnologies公司〕.1.2方式方法1.2.1细胞分离与培养：小鼠经3%戊巴比妥钠〔30mg/kg〕腹腔注射麻醉，断头处死。取出脊髓组织，用滤纸去除软脊膜，剪碎成约1mm1mm1mm大小，整个经过在冰上操作。参加DMEM、Ⅱ型胶原蛋白酶〔1g/L〕、DNaseⅠ〔15mg/L〕,37℃消化1.5h.1000g离心8min,弃上清液，20%BSA-DMEM重悬；4℃1000g离心20min.弃上清，参加DMEM、collagenase/dispase〔1g/L〕、DNaseⅠ〔6.7mg/L〕,37℃消化1h.参加DMEM,700g离心6min.弃上清，参加含20%BSA-DMEM重悬。4℃1000g离心20min.弃上清后DMEM重悬，悬液内即含微血管片段。将微血管片段用DMEM洗2次，1000g离心8min,700g离心5min.弃上清重悬后用细胞滤器过滤。用ECM将微血管片段接种至两个fibronectin〔10mg/L〕包被好的35mm培养皿。72h后用PBS清洗3次，以去除漂浮的死细胞以及其他杂质，之后继续用ECM培养。每隔3d换液1次，自原代细胞从微血管片段爬出到细胞完全汇合需7~9d.待细胞汇合后用胰蛋白酶消化传代2次，均使用ECM进行培养。从第3次传代后，用PCM培养。取第5代细胞用于细胞鉴定实验〔图1〕.1.2.2细胞鉴定：1〕倒置显微镜观察SCMP的形态：用倒置显微镜每隔24h观察细胞从微血管片段爬出及增殖状况并拍照。2〕细胞免疫化学方式方法鉴定：待细胞增殖汇合至75%左右，对细胞进行固定和透化处理。分别参加一抗〔PDGFR、NG2、vWF和GFAP〕〔1∶200〕,4℃孵育过夜；PBS洗5min共3次；分别参加荧光标记二抗，室温下孵育1h,PBS洗5min共3次；DAPI染色5min,PBS清洗；封片。荧光显微镜〔DP72,Olympus公司〕下观察并拍照，用ImageProPlus7.0〔IPP〕进行定量分析，实验重复3次。3〕流式细胞术检测细胞外表蛋白PDGFR、CD11b和CD31:消化并收集细胞，用流式染色工作液将细胞密度调整为11010个/L;取100L参加流式细胞仪测定管，添加20LFc受体阻断剂，并孵育10min;添加荧光直接标记的流式抗体和相应的同型对照抗体，4℃避光孵育30min;流式染色工作液清洗2次后，用PBS重悬至100L,用细胞筛制成单细胞悬液，行流式细胞仪检测。实验重复5次。4〕流式细胞术检测细胞胞质蛋白GFAP:消化并收集细胞，用FCSB将细胞密度调整为11010个/L;取100L参加流式细胞仪测定管，添加100L细胞内固定工作液，室温避光孵育30min;添加2mL透化液，400g室温离心5min后弃上清，用2mL透化液重悬；400g室温离心5min后弃上清；用100L透化液重悬，参加相应的抗体或相应的同型对照抗体，室温避光孵育30min;用FCSB清洗2次，用PBS重悬至100L后用细胞筛制成单细胞悬液，行流式细胞仪检测。实验重复5次。1.2.3细胞功能评价：1〕含10%FBS的DMEM培养基对细胞分化标志蛋白表示出的影响：①两组用PCM培养的第5代细胞，华而不实一组改用含10%FBS的DMEM培养；另外一组做为对照组继续用PCM培养。4d后用细胞免疫化学方式方法和Westernblot免疫印记法检测-SMA的表示出。②细胞免疫化学方式方法鉴定：对细胞进行固定和透化处理。分别参加一抗-SMA抗体〔1∶200〕,4℃孵育过夜；PBS洗5min共3次；参加荧光标记二抗，室温下孵育1h,PBS洗5min共3次；DAPI染色5min,PBS清洗；封片油封片。荧光显微镜下观察并拍照，用ImageProPlus7.0〔IPP〕进行定量分析，实验重复3次。③Westernblot免疫印记法：将培养至汇合的细胞收集并裂解。以每孔40g蛋白上样于10%SDS分离后，将蛋白转移至PVDF膜上。用抗小鼠-SMA抗体检测，以-actin为内参。实验1的比值表示。实验重复3次。2〕基质胶成管实验：①细胞荧光标记：脊髓微血管内皮细胞用红色荧光素DiI标记，SCMP用绿色荧光素DiO标记。将培养皿中的培养基吸出，参加染色培养基〔荧光染料与培养基以1∶200比例混匀〕,放置培养箱内孵育20min;将染色培养基吸出，参加正常培养基清洗3次〔每次清洗时用正常培养基孵育10min后再将其吸出〕.②以每孔25L基质胶包被96孔板，37℃30min使胶凝固。将SCMECs和SCMP以10∶1进行混合后进行接种，每孔接种5103个细胞，ECM最终体积为100L.24h后观察组成管情况。实验重复3次。1.3统计学分析数据用均数标准差〔xs〕表示，实验所用数据采用SPSS19.0软件处理，组间比拟采用单因素方差分析。2结果2.1倒置相差光学显微镜下观察细胞形态在内皮细胞培养基中，微血管片段呈典型的串珠状或分支状〔图2A〕;48h后，可见细胞从微血管片段中爬出〔图2B〕;4d后，细胞逐步增加，细胞形态多样〔图2C〕;7~9d后细胞汇合〔图2D〕;细胞传代后〔第2代〕继续在ECM中培养，可见纺锤状的内皮细胞和多边形的周细胞呈现伴随状增殖〔图2E〕;传代后改用PCM培养，长梭状内皮细胞逐步减少，多边形、多突起的周细胞呈现优势增殖〔图2F〕.2.2SCMP的细胞免疫化学和流式细胞术鉴定对第5代的细胞进行免疫荧光染色鉴定，可见细胞PDGFR和NG2双阳性〔图3A~C〕;vWF〔内皮细胞〕和GFAP〔星形胶质细胞〕阴性〔图3D,E〕,表示清楚得到的细胞中没有内皮细胞和星形胶质细胞的污染。流式细胞仪检测结果显示，PDGFR的阳性率为95.52%2.55%,而GFAP为0.63%0.26%,CD31〔内皮细胞〕为0.80%0.26%,CD11b〔小胶质细胞〕为1.02%0.35%〔图4〕.2.310%FBS-DMEM培养基促进SCMP的分化SCMP在PCM中培养2~3d即可传代。细胞保持典型的多角形形态但是体积较小，且-SMA低表示出〔图5A〕;换用DMEM培养4d后，-SMA的表示出明显上调〔图5B〕,且部分细胞体积增大，Westernblot结果〔图5C〕表示清楚-SMA的变化情况与细胞免疫化学法检测结果一致。2.4SCMP与SCMECs联合培养共同成管红色荧光标记的SCMECs和绿色荧光标记的SCMP以10∶1的比例共培养在基质胶上，24h后能够观察到两种细胞黏合在一起，共同组成管腔样构造〔图6〕.3讨论有文献报道使用匀浆研磨结合酶消化分离微血管[4-6],通过振荡消化使细胞从微血管片段上脱离。但得到的微血管活力差，细胞存活率低，时间和力度难掌控。而采用机械剪切、两步酶消化结合20%BSA离心获得微血管片段，避免了研磨对微血管的损伤，增加了细胞的生存概率。通过微血管片段获取周细胞会面临杂细胞的污染。从微血管上脱落的既包含内皮细胞和周细胞，也有小胶质细胞和星形胶质细胞。根据本实验室分离内皮细胞的经历体验[7],用ECM培养内皮细胞时存在周细胞的污染，而且周细胞会抑制内皮细胞的增殖[8],但在ECM中胶质细胞的生长会受到抑制[9-10].因而，先用ECM培养微血管，待胶质细胞被抑制后改用PCM来抑制内皮细胞。细胞免疫化学和流式细胞术鉴定的结果表示清楚，该方式方法的内皮细胞和胶质细胞的污染显著降低。用6~8周龄的小鼠分离细胞，从微血管内爬出的细胞数量少，活性低。改用3周龄小鼠，则细胞活力强，存活率高。细胞在25cm2〔或更大〕培养瓶中不易生长，而在35mm培养皿中细胞能够很快构成汇合，生长状态良好。进而证明中枢神经系统微血管单元的细胞不合适大的生长空间[11].周细胞是多能干细胞，在体外培养经过中能够快速分化[12],也有人以为其在传代经过中能够保持一定的稳定[13].周细胞常用的标志蛋白为PDGFR和NG2[14-15],但也有研究表示清楚，周细胞能够表示出一种与血管平滑肌细胞一样的收缩蛋白-SMA.体内和新分离的微血管周细胞不表示出-SMA,而体外培养中周细胞会逐步表示出该蛋白，因而-SMA被以为是一种周细胞分化的标志蛋白[14].本研究发现，PCM中的周细胞体积小，-SMA表示出低；换用DMEM培养4d,部分细胞的体积增大、突触增加，且-SMA表示出明显上调，表示清楚细胞具有一定的分化能力。成管实验表示清楚，分离的SCMP能够与内皮细胞共同构成管腔样构造。综上所述，本研究建立了一种分离原代SCMP的方式方法。具有操作简单、经济等优点，能够得到纯度高和活力较强的周细