微生物检验第十一章弧菌属

问题:

在前面我们所学习的章节中能引起腹泻的病原菌有哪些?弧菌属(Vibrio)侯珏临床微免教研室

目的与要求1.掌握霍乱弧菌及副溶血弧菌的主要生物学性状、微生物鉴定方法2.熟悉霍乱弧菌及副溶血弧菌致病性3.自学气单胞菌属和邻气单胞菌属一、概述弧菌科(Vibrionaceae)包括8个菌属

弧菌属(Vibrio)

盐弧菌属

(Salinivibrio)

异单胞菌属(Allomonas);

链状球菌属(Catenococcus);

肠弧菌属(Enterovibrio);GrimontiaListonella

发光杆菌属（Photobacterium）

共性：革兰氏染色阴性氧化酶阳性发酵糖类具有极端单鞭毛弧菌属

分布广泛,水中最多共66个种,引起人类致病的12种

弧形或短杆、革兰阴性菌单鞭毛能发酵葡萄糖氧化酶阳性(除麦氏弧菌外)对弧菌抑制剂O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感钠离子能刺激其生长,部分菌株嗜盐致病性弧菌所引起的疾病种所致疾病临床意义标本来源O1群霍乱弧菌霍乱主要致病菌粪便O139群霍乱弧菌霍乱主要致病菌粪便非O1群霍乱弧菌胃肠炎主要致病菌粪便、血副溶血弧菌胃肠炎主要致病菌粪便、伤口创伤弧菌败血症、伤口感染主要致病菌粪便、伤口少女弧菌伤口感染散发感染伤口溶藻弧菌伤口感染散发感染耳、伤霍利斯弧菌胃肠炎散发感染粪便拟态弧菌胃肠炎散发感染粪便河弧菌胃肠炎罕见感染粪便麦氏弧菌胃肠炎罕见感染粪便氟尼斯弧菌胃肠炎罕见感染辛辛那提弧菌菌血症、脑炎罕见感染鲨鱼弧菌伤口感染罕见感染12种致病性弧菌的致病性差别较大，所致疾病的种类和毒性差别较大。致病菌中，最重要的，出问题最多的是O1型霍乱弧菌、非O1型霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌

霍乱弧菌(V.cholera)

一、概述霍乱弧菌是霍乱的病原菌我国《传染病防治法》甲类传染病到目前为止共发生了七次霍乱世界大流行流行情况1817-1923年六次大流行印度恒河三角洲古典生物型1961年第七次大流行

ElTor生物型1992年孟加拉湾

O139群

A亚单位（毒性亚单位）B亚单位（结合亚单位）霍乱肠毒素的结构模式图二、临床意义1.致病物质侵袭力：鞭毛菌毛

荚膜（O139）霍乱肠毒素（choleraenterotoxin

,CE)霍乱肠毒素(A、B亚单位)

B亚单位与肠粘膜上皮细胞GM1受体

A片段进入细胞激活腺苷酸环化酶ATP→cAMP↑─→肠粘膜分泌大量水和电解质腹泻、呕吐、水、电解质紊乱、循环衰竭等

霍乱肠毒素的作用机制2.所致疾病霍乱由01群及0139群霍乱弧菌引起烈性肠道传染病主要表现：剧烈的上吐下泻胃肠炎由非01群霍乱弧菌引起无明显季节分布，不引起霍乱流行形态与染色

三、生物学特性革兰染色阴性弧型或逗点状米泔水样粪便直接涂片染色镜检：可见“鱼群样排列"

长期培养可变为杆状单端单鞭毛，无荚膜，无芽胞活菌悬滴镜检,可见“穿梭或流星状运动”

Vibriocholerae营养要求不高，生长较快兼性厌氧，氧气充分生长良好（液体培养基中形成菌膜）最适生长温度：35℃怕酸嗜碱，最适pH:7.2-7.4pH:7.4-9.6快速生长

初次分离:pH8.5

0%～0.5%NaCl培养基中可生长，但生长不良0.5%～1%NaCl培养基中生长良好

培养特性培养特性

选择性的增菌培养基:碱性蛋白胨水（APW)pH8.5

常用的强选择性培养基：庆大霉素琼脂(GTA)pH8.4（庆大霉素、多粘菌素B、亚碲酸钾）四号琼脂pH8.4（庆大霉素、亚碲酸钾）

TCBS琼脂pH8.6（硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖）常用的弱选择性培养基：碱性琼脂pH8.4碱性胆盐琼脂pH8.4培养特性

菌落特征TCBS琼脂：形成圆形、微凸、表面光滑湿润整齐、大黄色菌落庆大霉素培养基：扁平、湿润、半透明菌落中心呈灰褐色（含亚碲酸钾）血琼脂上形成的菌落较大，ELTor生物型可形成β-溶血霍乱弧菌培养于TCBS琼脂（37℃，18小时）发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色霍乱弧菌菌落特征（4号琼脂）

因能还原亚碲酸钾中心呈褐色

生化反应氧化酶（+）发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖产酸不产气、不分解阿拉伯糖霍乱红试验(+)：粘丝试验（+）：去氧胆酸钠溶液与新鲜菌混匀成浓菌悬液，1min内悬液由混变清，并变得粘稠，以接种环挑取时可拉丝为阳性O129敏感试验：10μg（S）、150μg

（S）鸟氨酸、赖氨酸脱羧酶(+)、精氨酸双水解酶（-）耐盐试验：0%NaCL（+）、3%NaCL（+）、

7%NaCL（-）、10%NaCL（-）亚硝酸吲哚

红色硝酸盐亚硝酸盐色氨酸吲哚浓硫酸霍乱红反应（choleraredtest）

鸟氨酸及赖氨酸脱羧酶试验抗原性O抗原：耐热，耐受100℃2h

特异性高，分群和分型的基础H抗原：不耐热，特异性低

分群和分型根据O抗原不同:霍乱弧菌分155个血清群血清群

生物型

血清型

O1群

古典型

小川型(AB)与O1抗血清凝集（+）

ElTor型

稻叶型(AC)

彦岛型(ABC)

非O1群(与O1抗血清凝集（-）)(O2-155群)

O1群:

1)O-1群霍乱弧菌：包括古典生物型和Eltor生物型。可引起霍乱

2)不典型O-1群霍乱弧菌：属于O-1群，但不致病O1群霍乱弧菌的血清分型型别型别O抗原成份原型稻叶型（Inaba）A、C异型小川型（Ogawa）A、B中间型彦岛型（Hikojima）A、B、C血清型：O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成抗原A：共同的特异性抗原

性状\生物型古典型ELTorⅣ组噬菌体裂解+-Ⅴ组噬菌体裂解-+对多粘菌素B的敏感性SR鸡RBC凝集-+羊RBC溶血-+V-P-+霍乱弧菌两个生物型的鉴别

生物型：

根据表型差异,O1群霍乱弧菌有古典生物型和E1Tor生物型之分

抵抗力较弱怕干——干燥时易死亡，水环境中可存活两周（水源性传播，水性爆发）怕酸——正常胃酸4min不耐热——100℃，1-2min对消毒剂、抗生素敏感:消毒(漂白粉：吐泻物（1：4）,1hr)

庆大霉素耐药

０139群霍乱弧菌O139血清群是已发现的第一个能引起霍乱流行的非０1群霍乱弧菌目前世界卫生组织规定，霍乱病原菌包括O1群霍乱弧菌与O139群霍乱弧菌与O1群霍乱弧菌相同的霍乱毒素（Choleratoxin,CT），所引起的霍乱在临床和流行病学上也与O1群霍乱弧菌所致霍乱基本相同与Ｏ1群霍乱弧菌O抗原不同；O22群与O155群有交叉反应对弧菌抑制剂０/129的低浓度和高浓度均具有抗性具有荚膜对多种抗生素耐药四、微生物学检查1.标本采集粪便（主）肛拭子呕吐物尸体肠内容物发病早期采集标本以“米泔水”样便为主，及时送检不能立即检查的，要放入碱性蛋白胨水或卡－布培养基保存严密包装，专人送检“米泔水”样便2.直接检查(只作初步诊断参考，不能作确诊依据)（1）直接涂片镜检:标本涂片2张，分别用革兰染色及1：10稀释复红染色，镜检观察有无革兰染色阴性呈鱼群状排列的弧菌（2）动力及制动试验动力观察：采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力的细菌制动试验：悬滴检查阳性标本，霍乱多价诊断血清（效价1：64），用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性（3）直接荧光抗体染色（4）CT测定3.分离培养：增菌培养:APW，35℃6-8h分离培养：弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等

现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离

检验方法4.鉴定:血清学为主，结合形态学、生化反应作出判断（1）初步鉴定：血清学鉴定试剂;O1群霍乱弧菌诊断血清

O139群诊断血清方法：玻片凝集试验——

从分离培养基上挑取可疑菌落于霍乱弧菌多价诊断血清作玻片凝集试验。诊断血清应稀释成1:32-1:64的效价使用，立即出现凝集者为阳性，同时设生理盐水和阳性细菌株对照2.鉴定（NA分纯培养物）初筛试验：形态、血清群复核（玻片凝集试验）、氧化酶（+）霍乱弧菌的鉴定：

分解葡萄糖、蔗糖，产酸不产气霍乱红试验（+）、粘丝试验（+）、

O/129敏感试验10μg（S）、150μg

（S）耐盐试验:3%NaCl(+),6%NaCl(+)0%NaCl(+),10%NaCl(-)

赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）

3.分型鉴定(1)血清学分型：小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应小川型单价血清凝集稻叶型单价血清小川型+-稻叶型-+彦岛型++(2)生物学分型：古典型和埃尔托型的鉴别

O1血清分群生物学分型血清学分型霍乱弧菌非O1群O1群古典型ELTor型小川型稻叶型彦岛型小川型稻叶型彦岛型霍乱弧菌的分群及分型我国流行以ElTor、小川型霍乱弧菌为主检验程序

分型鉴定鉴定依据

1、形态学G—弧菌或杆菌，具有活泼动力，制动试验阳性；2、培养特点

弧菌选择培养基上菌落形态典型；3、血清学能与霍乱弧菌诊断血清发生明显凝集；4、生化反应分解葡萄糖、蔗糖，产酸不产气氧化酶试验（+），霍乱红试（+）粘丝试验（+）,O/129敏感试验(s)报告方式

1、标本直接镜检：见形态典型、运动活泼、制动试验（+），可作初报2、若确定为霍乱弧菌，可报告：经培养有霍乱弧菌生长，

群

生物型

血清型副溶血弧菌

Vibrioparahaemolyticus一、概述隶属于弧菌科弧菌属具有嗜盐性,需在NaCl浓度较高(3%-4%左右)的环境中才能生长繁殖是沿海地区食物中毒和急性腹泻的主要病原菌二、临床意义

1、致病因素:粘附因子和毒素（1）菌毛（2）毒素

1）耐热性溶血素细胞致死活性溶血作用肠毒性作用心脏毒性

2）耐热相关溶血素2、所致疾病

食物中毒、急性胃肠炎

三、生物学性状

形态与染色

革兰阴性菌常呈多形性：杆状或稍弯曲的弧状,

球状、球杆状、长杆状无荚膜、无芽胞单鞭毛培养特性

生物学性状具有嗜盐性，氯化钠的最适浓度为3.5%；无盐不生长，＞8%不生长增菌培养基:1%NaCl碱性蛋白胨水

4%NaCl蛋白胨水TCBS琼脂:菌落圆形、隆起、光滑、湿润、不透明，蓝绿色SS琼脂：2-3mm，扁平、无色、半透明、蜡滴状，菌落不易挑起我萋培养基(Wagatsumaagar)：神奈川现象（Kanagawaphenomenon，KP)

致病性副溶血性弧菌能溶解人或兔红细胞，产生β–溶血现象

生物学性状生化反应

(1)耐盐试验3%NaCl(+),7%NaCl(+)