高浓度培养乳酸菌发酵培养基的优化

高浓度培养乳酸菌发酵培养基的优化吴军林;柏建玲;莫树平;张菊梅【摘要】TheoptimizationoffermentationmediumforastrainofLactobacillusR8,whichhadbeenprovedtoberesistanttoacidandbile,laysafoundationfortheprobioticstobeusedtoimprovethegastrointestinaltracthealthyfood.Thecomponentsoffermentationmediumwereoptimizedbysinglefactortestandorthogonaldesigntestbasedonthedensityofbacteria.Theresultsshowedthatthebestfermentationformulaforthebacteriumwas:glucose20.0g,yeastpowder30.0g,MnSO4-4H2O0.075g,MgSO4-7H2O2.0g,KH2PO42.5g,citricacidammonium2.5g,CH3COONa-3H2O6.25g,Tween801.0mL,pH6.2.Afteroptimization,theconcentrationofbacteria(OD600nm)reached2.38.%对一株已经证实具有耐酸、耐胆汁的乳杆菌R8菌株进行培养基的优化研究，以菌体密度为检测指标，采用单因素实验和正交设计实验优化发酵培养基组分，为该益生菌应用于改善胃肠道的健康食品奠定基础.结果显示，该菌最佳发酵配方为:葡萄糖20.0g,酵母粉30.0g,MnSO4・4H2O0.075g,MgSO4・7H2O2.0g,KH2PO42.59，柠檬酸铵2.5g,CH3COONa・3H2O6.25g,Tween801.0mL,pH6.2.培养基配方经过系统筛选和优化后，菌体浓度(OD600nm)达到2.38.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷)，期】2018(039)009【总页数】6页(P96-101)【关键词】乳酸菌;益生菌;发酵培养基【作者】吴军林;柏建玲;莫树平涨菊梅【作者单位】广东环凯微生物科技有限公司，广东广州510643;广东省微生物研究所广东广州510070;广东省微生物研究所广东广州I510070;广东省微生物研究所，广东广州I510070;广东省微生物研究所广东广州510070【正文语种】中文【中图分类】TS201.3乳酸菌(LacticacidbacteriaLAB)是指一群利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称［1］。乳酸菌是一类对人体有益的微生物菌群，广泛分布在自然界。乳酸菌发酵能产生大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌等生理功效［2］。高密度培养没有确切的定义，是一个相对概念，指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率［3］。这种培养优势在于缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大提高产品市场竞争力［4］。乳酸菌要通过高密度培养技术达到理想的高浓度产量，需要优化一系列相关的工艺参数来对发酵过程进行严格的控制［5］。通过解决这些问题，设计出合适的培养途径达到理想的菌体浓度。研究报道表明，影响乳酸菌增殖的因素有很多，如菌种的活力、培养代数、培养周期、培养液的初始pH、培养温度、培养时间、接种量、增殖因子等，其中培养基的物理性质及成分会严重影响到乳酸菌菌体的收集工作，所以培养基的选择多选用粘度小、蛋白质含量低的透明液［6］。另外培养基选择合适的营养物质和适当浓度的营养物质是达到菌体高密度的重要途径之一［7］。本文根据乳杆菌R8菌的特性，筛选了最优的碳源和氮源,对培养基碳氮量及碳氮比、微量元素、缓冲体系、组分构成比例进行了优化，确定适宜R8菌高密度培养的发酵培养基。1材料与方法1.1材料与仪器乳杆菌R8由广东省微生物研究所检测新技术组筛选驯化提供[8]；MRS培养基、改良MRS培养基广东环凯微生物科技有限公司。SIGMA3K15台式冷冻离心机德国SIGMA公司;LRH-250生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司;UV-1800全波长扫描分光光度计日本岛津公司。1.2实验方法1.2.1培养方法1.2.1.1培养基制备MRS培养基(g/L):葡萄糖20.0g,胰蛋白腺10.0g,牛肉膏8.0g,酵母粉4.0g,Tween801.0mL,K2HPO42.0g,MgSO4・7H2O0.2g,MnSO4・4H2O0.05g,柠檬酸铵2.0g,CH3COONa・3H2O5.0g,蒸馏水1000mL,pH6.2。液体种子及发酵培养基一改良MRS培养基(g/L):葡萄糖20.0g,酵母粉30.0g,MgSO4・7H2O2.0g,KH2PO42.5g,柠檬酸三铵2.5g,CH3COONa・3H2O6.25g,Tween801.0mL,pH6.2。平板计数用培养基：改良MRS液体培养基加1.5%~2%琼脂。1.2.1.2菌种保存乳杆菌R8菌株于甘油管中-20°C保存。1.2.1.3液体种子培养取冻存的R8菌株，按2%的接种量接种于改良MRS培养基(100mL培养基/250mL三角瓶),37C培养16h。1.2.1.4液体发酵培养将种子液按2%接种量接种于改良MRS培养基(50mL培养基/250mL三角瓶),37C培养20h[8-9]。1.2.2培养基碳源及氮源的筛选在MRS培养基的基础上，不改变氮源等其它成分，分别采用不同的碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、低聚麦芽糖、可溶性淀粉)和在MRS培养基的基础上，不改变碳源等其它成分，分别采用不同的氮源(胰蛋白腺、酵母粉、麦芽提取物、大豆蛋白腺、牛肉膏、(NH4)SO4、KNO3)配制培养基，接种发酵，测定菌液OD600值，确定最佳的碳源及氮源。1.2.3培养基碳氮量及碳氮比的优化在确定了最佳碳源及氮源后，在MRS培养基基础上，选择0.5:1、1.0:1、2.0:1、3.0:1的碳氮比配置培养基[10],接种发酵，测定菌液OD600值，确定适宜的碳氮量及碳氮比。1.2.4培养基微量元素的优化以优化的碳氮源的培养基为基础，分别添加不同量的不同微量元素(MgSO4・7H2O2g/L,MnSO4・4H2O0.075g/L,FeSO4-7H2O0.2g/L,ZnSO4・7H2O0.05g/L,CaCl20.1g/L)[10],以不添加微量元素作参照，接种发酵，测定菌液OD600值，确定微量元素的种类及用量。1.2.5培养基缓冲体系的优化以优化了碳氮源及微量元素的培养基为基础,不同种类的缓冲体系(Na2HPO4/NaH2PO4、K2HPO4/KH2PO4、Na2HPO4/KH2PO4、柠檬酸/柠檬酸钠、Na2HPO4/柠檬酸、柠檬酸铵/乙酸钠/KH2PO4)分别以不同浓度(0.00、0.02、0.04、0.08、0.10mol/L)添加，以不添加缓冲体系的培养基为对照，接种发酵，测定菌液OD600值，确定最优的缓冲体系。1.2.6培养基组分构成比例优化通过培养基单因素实验确定了适合R8菌生长的碳氮源、微量元素及缓冲体系，设计三因素两水平考虑交互作用的正交实验，以菌液的OD600值作为响应值碳源含量(X1)、氮源含量(X2)、缓冲盐含量(X3)为自变量，实验因素及水平设计见表1。表1三因素二水平设计表Table1Threefactorsandtwolevelsusedinorthogonaltestdesign因素水平12X1碳源(g/L)20.030.0X2氮源(g/L)20.030.0X3缓冲盐(mol/L)1.01.51.2.7检测方法1.2.7.1发酵液菌体干重测定取一定体积的发酵液,8000r/min离心10min后用无菌水洗涤两次，再将菌体60°C干燥后称重，即可算得菌体干重，以g/L表示。1.2.7.2发酵液浓度测定取一定体积培养液8000r/min离心10min,弃上清液，用等体积的无菌生理盐水洗涤两次后将菌体悬浮，测定600nm下的吸光度值。1.2.7.3菌液活菌数测定菌液用梯度稀释法稀释到一定倍数后涂平板,37C培养48h计数,结果以cfu/mL表示［9］。1.3数据处理所有数据采用SPSS13.0软件包进行方差分析，结果均以均数士标准差表示2结果与分析2.1培养基碳源优化碳源是培养基主要成分之一，主要功能有两方面:一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源及合成菌体所需的碳骨架;二是为菌体合成目的产物提供原料。常用碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇等［11］。一般葡萄糖适合乳杆菌的生长。熊涛［12］、隋春光［13］等对植物乳杆菌高密度培养进行研究，优化碳源，发现葡萄糖是最佳碳源。本实验主要以不同的糖类作为碳源进行培养，结果如表2所示。表2在不同碳源培养基中R8菌的菌体密度Table2AbsorbancesofLactobacillusR8grown碳源(2%)菌体密度(OD600)葡萄糖2.3343±0.0030a果糖2.2584±0.0037b乳糖2.3495±0.0032a蔗糖1.3150±0.0146d低聚麦芽糖1.5140±0.0030c可溶性淀粉1.3036±0.0036d注:相同字母的数据之间差异不显著(p>0.01),不同字母的数据之间差异显著(p<0.01)。表3、表4同。表2显示,不同的碳源对于R8的生长影响显著(p<0.01)，其中葡萄糖和乳糖的菌液OD600值最高，表明R8菌对葡萄糖和乳糖的利用能力最强,其次为果糖；蔗糖、可溶性淀粉利用能力较弱。故采用单因素实验筛选出的碳源物质为葡萄糖和乳糖，但二者之间无显著性差异。因考虑成本(乳糖是葡萄糖价格的两倍以上)，选择葡萄糖作为最佳碳源。2.2培养基氮源优化氮源主要用于构成菌体细胞和合成含氮代谢产物，主要包括有机氮源与无机氮源两大类［14］。本实验选择了5种有机氮源和2种无机氮源进行培养，结果如表3。表3在不同氮源培养基中R8菌的菌体密度Table3AbsorbancesofLactobacillusR8grownwithdifferentcarbonandnitrogen氮源(2%)菌体密度(OD600)胰蛋白腺1.9047±0.0216c酵母粉2.4126±0.0101a麦芽提取物1.7645±0.0257d大豆蛋白腺2.1465±0.0035b牛肉膏1.0034±0.0135e(NH4)2SO40.3701±0.0167fKNO30.3788±0.0072f表3显示，不同氮源对R8生长的影响差异显著2<0.01),整体看有机氮源要优于无机氮源，这主要因为乳酸菌自身酶系简单，许多氨基酸不能自身合成，需从外界摄取，有机氮源除了提供氮外，还含有丰富的氨基酸及维生素，更利于菌体的生长［15］。从表3可得酵母粉的效果最好，大豆蛋白腺次之,其它几种氮源效果相对较差，有许多对乳酸菌的研究都表明酵母粉是最适宜的氮源,如洪梅［16］、姚国强［10］等对不同乳杆菌培养条件进行优化，发现最佳氮源都为酵母粉，因此选择酵母粉作为最佳氮源。2.3培养基碳氮比优化培养基中的碳氮比例对微生物生长及产物合成的影响极为显著［11］。氮源过量使菌体生长过于旺盛，易引起菌体的衰老和自溶;碳源过量则易形成较低的pH,不利于菌体生长［17］。不同碳氮量及碳氮比对菌体生长的影响结果见图1。由图1可看出培养基碳氮比例的不同对R8菌生长影响显著(p<0.01),从碳氮比例看，在0.5~1之间时，菌体生长相对较好，当碳氮比大于1时菌体浓度明显下降。从碳氮总量看，菌体浓度随着碳氮总量的提高而升高，但总量为40g/L和50g/L时，菌体浓度无显著变化(p>0.01)o图1不同碳氮量及碳氮质量比对R8生长的影响Fig.1Effectsoftotalconcentrationofnitrogenandcarbonandcarbon/nitrogenratioontheabsorbanceofLactobacillusR8注：相同字母的数据之间差异不显著(p>0.01)，不同字母的数据之间差异显著(p<0.01)。图2Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+对R8生长促进作用比较Fig.2Effectsofdifferenttypesoftraceelements(Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+)onabsorbanceofLactobacillusR82.4培养基微量元素的优化Fe,Mg,Mn,Zn,Ca等微量元素作为酶的激活剂或生物活性物质的组成成分也是微生物在生长过程中不可缺少的。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物的合成有促进作用，高浓度时则表现出明显的抑制作用［11］。图2显示了分别在培养基中添加不同浓度的MgSO4・7H2O,MnSO4・4H2O,FeSO4・7H2O,ZnSO4・7H2O,CaCl2时R8的生长情况。由图3可以看出与不添加微量元素相比,适量的添加一些微量元素有利于菌体的生长当添加超过一定量时对菌体生长的促进作用会降低，而过量添加Zn2+会对菌体的生长产生明显的抑制作用。由图3可看出Mn2+对菌体生长的促进作用最为明显MnSO4・4H2O的最适添加量为0.075g/L,菌浓比对照组提高20.7%。Mn2+作为乳酸脱氢酶的组成成分，是促进乳酸菌生长的关键因子之一,已有报道利用L.casei发酵乳清水解物生产乳酸时需补充Mn2+以提高乳糖的利用率及乳酸产率［18］。其次是Mg2+,当MgSO4・7H2O的最适添加量为2g/L,菌浓比对照组提高15.5%。考虑到糖酵解的大部分过程中都必须有Mg2+作为辅助因子，所以选择添加Mn2+和Mg2+。图3不同浓度的Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+对R8生长的影响Fig.3Effectsofdifferentconcentrationsoftraceelements(Mn2+,Mg2+,Fe2+,Ca2+,Zn2+)onabsorbanceofLactobacillusR82.5培养基缓冲体系的优化在培养基中添加缓冲盐，一方面可调节细胞的渗透压，另一方面主要是对发酵代谢产酸的细菌而言，添加缓冲盐可以缓解乳酸造成的低pH对菌体的抑制作用。常用的缓冲体系有柠檬酸盐、磷酸盐和乙酸盐等。不同缓冲体系对R8菌生长影响结果见表4。由表4可看出具有缓冲体系的培养基中的菌体浓度明显要高于对照组，不同缓冲体系之间以及同一缓冲体系不同浓度之间的差异显著(p<0.01)，其中柠檬酸铵/乙酸钠/KH2PO4缓冲体系最适于R8菌的生长。表4在不同缓冲体系培养基中R8菌的菌体密度Table4AbsorbanceofLactobacillusR8indifferentbufferedsalt缓冲体系不同缓冲盐浓度(mol/L)下的菌体密度(OD600)0.000.020.040.080.10Na2HPO4/NaH2PO42.1899±0.0026lm2.2002±0.0048ijkl2.2261±0.0050hi2.2220±0.0078ijK2HPO4/KH2PO42.1975±0.0054jkl2.2186±0.0103ijk2.2485±0.0060gh2.2509±0.0158fghNa2HPO4/KH2PO42.1653±0.0045m2.1872±0.0051lm2.1957±0.0176kl2.2497±0.0020fgh2.2538±0.0024fg柠檬酸/柠檬酸钠2.3064±0.0038d2.3554±0.0047bc2.3510±0.0073c2.2756±0.0047efNa2HPO4/柠檬酸2.2062±0.0084ijkl2.2561±0.0081fg2.2693±0.0073fg2.2960±0.0073de柠檬酸铵/乙酸钠/KH2PO42.2579±0.0017fg2.3060±0.0045d2.3770±0.0015b2.4058±0.0035a2.6正交实验法优化培养基组分构成比例本研究采用三因素二水平的考虑交互作用的正交实验设计对培养基中主要成分（碳源、氮源、缓冲体系）的含量进行优化，以菌液浓度（OD600nm）为响应值确定出最适培养基配方，实验方案设计及结果见表5。表5考虑交互作用的正交实验设计及结果表Table5Theorthogonaltestdesignandresultstableconsideringinteraction实验号因素及水平X1X2X1xX2X3X1xX3X2xX3误差菌液浓度（OD600nm）111111111.9352211122221.8648312211222.3792412222112.1852521212121.7380621221211.6184722112212.1112822121121.9272k12.0911.7891.9602.0411.9651.9461.963k21.8492.1511.9801.8991.9751.9931.977R0.2420.3620.0200.1420.0100.0470.014表6方差分析表Table6Thevarianceanalysistable因素离差自由度均方离差F值p显著性X1（葡萄糖）0.11810.11894.4000.005*X2（酵母粉）0.26210.262209.6000.002*X1X20.00110.0010.8000.321X3（缓冲盐）0.04010.04032.0000.005*X1X30.00010.0000.0000.212X2X30.00410.0043.2000.06误差0.00540.00125注:*表示差异显著（p<0.01）。对表5中的实验结果进行直观分析，从不同因素所对应的极差值可看出因素X2（酵母粉）对菌体浓度的影响最大，其次是因素X1（葡萄糖）,再次是X3（缓冲盐），三个因素间的交互作用对菌体浓度的影响不明显。从表5中可得出优化后的组合为X1（葡萄糖）20g/L,X2（酵母粉）30g/L,X3（缓冲盐）1.0mol/L。对实验结果进行方差分析,分析结果见表6。在表6中,X1X2,X1X3,X2X3的离差相对很小，说明这三项的作用不显著2>0.01）,将这三项并入误差项，并取误差项的自由度为4相自由度之和，进而算得均方离差及F值。由方差分析的结果可知葡萄糖，酵母粉和缓冲盐对菌体的生长具有显著影响(p<0.01),而三种营养成分之间的交互作用对菌体生长并无显著影响(p>0.01)。经过以上系统的筛选和优化,确定适宜的发酵培养基配方(g/L)为:葡萄糖20.09酵母粉30.0g,MnSO4・4H2O0.075g,MgSO4・7H2O2.0g,KH2PO42.5g,柠檬酸铵2.5g,CH3COONa・3H2O6.25g,Tween801.0mL,pH6.2。菌体浓度(OD600nm)达到2.38。3结论针对前期筛选出的耐胃液耐胆汁菌株R8的营养需求,对其发酵培养基的成分及含量进行系统的筛选和优化,确定适宜的发酵培养基配方(g/L):葡萄糖20.0g,酵母粉30.0g,MnSO4・4H2O0.075g,MgSO4・7H2O2.0g,KH2PO42.5g,柠檬酸铵2.5g,CH3COONa・3H2O6.25g,Tween801.0mL,pH6.2。菌体浓度(OD600nm)达到2.38。乳酸菌在生长过程中会产生大量的乳酸，使pH下降到菌体耐酸的极限,此时即使有充足的营养，菌体细胞的进一步生长也会受到抑制［19-21］。因此仅提供足够的营养物质还不够，必须通过补充营养物质、排出代谢产物、调节pH等措施，尽量减少和降低代谢产物对菌体生长的抑制［22-25］。因此接下来需要对R8菌株的培养条件、培养方式等进行深入研究,为该菌的后续工业化生产奠定基础。参考文献【相关文献】［1］ 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