new核酸的理化性质

第14章核酸的重要理化(Hua)性质0第一页，共七十四页。DNA与RNA的(De)差异

DNA

RNA固体白色纤维状大多为线形分子细长溶液粘度大与酸和二苯胺共热产生蓝紫色白色粉末状分子量较DNA小得多溶液粘度小能在室温条件下被稀碱水解成核苷酸与浓盐酸和苔黑酚共热产生绿色第二页，共七十四页。核酸的物(Wu)理化学性质核酸的糖苷键和磷酸二酯键可被酸、碱或各自相应的核酸酶水解成为各种成分，其水解程度因水解条件而异核酸和核苷酸既有磷酸基团，又有碱性基团，都是两性电解质——酸碱性质DNA和RNA都微溶于水，不溶于有机溶剂，提取分离核酸时，可用乙醇将核酸从溶液中常沉淀出来核酸的紫外吸收特性因其所含碱基而引起核酸的变性与复性与其双螺旋结构有关。第三页，共七十四页。一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫(Zi)外吸收性质四、核酸的变性、复性及杂交核酸的物理化学性质第四页，共七十四页。一、核酸的(De)水解（一）酸水解糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解嘌呤碱基的糖苷键比嘧啶碱基的糖苷键对酸更不稳定第五页，共七十四页。（二(Er)）碱水解RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。由于RNA的核糖上有2’-OH基，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解产生，产生2’,3’-环磷酸酯，再水解成2’-核苷酸及3’-核苷酸相对而言DNA一般对碱稳定。第六页，共七十四页。（三(San)）酶水解非特异性——磷酸二酯酶5´

p

p

p

pOHB

p

p

p

p3´BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶（5´端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3´端外切3得5）5´3´结构式5'-核苷酸3'-核苷酸第七页，共七十四页。核(He)酸酶的分类（1）底物

RNaseDNase（2）按作用方式核酸内切酶核酸外切酶（5’→3’外切酶、3’→5’外切酶）（3）按断裂磷酸二酯键的方式（4）其他：双链酶、单链酶专一性水解磷酸二酯键——核酸酶有些核酸酶的特异性很高，能识别和切割DNA的特异序列，是重要的工具酶第八页，共七十四页。限制(Zhi)性内切酶

原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristrictionendonuclease）。山东落花生花落东山帘卷晚晴天，天晴晚卷帘WasitacatIsaw?第九页，共七十四页。常用的DNA限(Xian)制性内切酶的专一性酶辨认的序列和切口说明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口第十页，共七十四页。限制性内切酶对细菌有何益处(Chu)呢？30多年前,当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶.细菌可以抵御新病毒的入侵,而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶.作为微生物免疫机制的一部分行使其功能.当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时,大部分病毒颗粒都能成功地进行感染.一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降.出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧.

第十一页，共七十四页。限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶（甲基化酶）出现.后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏.修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同限制性内切酶和它的“搭档”--甲基化酶一起就构成了限制-修饰（R-M）系统.在一些R-M系统中,限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白,它们各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中,两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚(Ya)基,或是同一亚基的不同结构域来执行.

第十二页，共七十四页。二、核酸的酸碱性(Xing)质1、碱基的解离2、核苷的解离3、核苷酸的解离结合及释放质子的能力第十三页，共七十四页。碱基：含氮碱基，杂环化合物(Wu)（很多生物(Wu)碱的结构）1）、具有芳香环的结构特征，呈平面或近乎平面含有共轭双键体系，紫外区有吸收（260nm）。2）、氮原子位于环上或取代氨基上弱碱性来自于环上氮原子，pKa约9.5，倾向于接受H取代氨基（或曰碱基环外的氨基）碱性很弱，生理条件下不能被质子化。1、碱基的解离第十四页，共七十四页。1、碱基的(De)解离胞嘧啶第十五页，共七十四页。DNA嘧啶(Ding)碱基的解离尿嘧啶胸腺嘧啶第十六页，共七十四页。DNA嘌呤(Ling)碱基的解离腺嘌呤第十七页，共七十四页。鸟嘌呤的解(Jie)离第十八页，共七十四页。2、核苷(Gan)的解离糖存在影响了碱基的解离——增强了碱基的酸性解离核糖中羟基也可以发生解离第十九页，共七十四页。3、核苷酸的解(Jie)离表14-1（重在看懂、理解）第二十页，共七十四页。HHH某一基团解离的离子化程(Cheng)度腺苷酸的等电点为？2.3第二十一页，共七十四页。鸟苷(Gan)酸的等电点为1.55第二十二页，共七十四页。胞(Bao)苷酸的等电点为2.65第二十三页，共七十四页。碱性极弱，尿苷酸(Suan)基本可看做酸(Suan)性核苷酸(Suan)，不能算作兼性离子第二十四页，共七十四页。多核苷酸中磷酸二酯键中的磷酸基团只有一(Yi)个解离常数第二十五页，共七十四页。4、核酸的滴(Di)定曲线图14-2小牛胸腺DNA的滴定曲线反映出变性DNA的滴定曲线改变

碱基的暴露II从pH12或pH2.5分别反向滴定I从pH6.9用酸或碱正向滴定

I天然II变性

电极电位的变化，指示离子浓度的变化第二十六页，共七十四页。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为(Wei)4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。第二十七页，共七十四页。三、核酸的(De)紫外吸收性质两类核酸的紫外吸收谱均为260~290nm其最高吸收峰接近260nm第二十八页，共七十四页。DNA的紫外吸收(Shou)谱光吸收（A）波长/nm1是天然DNA;2是变性DNA；3是核苷酸总吸收值第二十九页，共七十四页。小(Xiao)量DNA或RNA的紫外吸收法定量测定1、

对待测样品是否纯的判断可用紫外分光光度计读出260nm和280nm的A值，计算A260/A280，从此值大小判断样品的纯度，纯的DNA的A260/A280应为1.8；纯的RNA应为2.0。2、

对纯核酸样品的定量测定只要测出260nm的A值，即可计算含量。通常以1个A单位相当于50ug/ml双螺旋DNA；或40ug/ml的单链DNA(或RNA)；或20ug/ml的寡核苷酸（或单核苷酸）。第三十页，共七十四页。四、核酸的(De)变性、复性与杂交(一)核酸的变性（denaturation）1、DNA的变性：

在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。第三十一页，共七十四页。

某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构(Gou)改变、理化性质及生物活性发生改变。

不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2、变性的实质第三十二页，共七十四页。降解(Jie)：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂第三十三页，共七十四页。DNA变(Bian)性第三十四页，共七十四页。

高温（一般＞75℃）—热变性(Xing)

强酸、碱

—酸碱变性

甲醛（Agarose中RNA）

尿素（PAGE中DNA）3、变性因素原理：与蛋白质变性相似，破坏空间结构中的次级键第三十五页，共七十四页。

OD260增高 粘(Zhan)度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失4、变性后理化性质变化第三十六页，共七十四页。第三十七页，共七十四页。完全变(Bian)性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA约1.1%实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称增色效应提供了一个很好的检测变性的方法！第三十八页，共七十四页。

变性RNA酶的分数是根据溶液的特性粘度(Du)增加、在365nm的旋光度变化和287nm紫外吸收变化变性RNA酶的分数温度Tm第三十九页，共七十四页。5、DNA热变性的特(Te)征变性过程是“跃yue变式”的，而非渐变解链曲线：连续加热DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线。第四十页，共七十四页。指增色效应达50%时(Shi)的温度一般DNATm值在85-90C之间Tm：DNA变性时，OD260达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。大小与G+C含量成正比。第四十一页，共七十四页。（1）DNA的均(Jun)一性：（2）G－C含量：

经验公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介质中的离子强度：

Tm值大小与下列因素有关：第四十二页，共七十四页。（1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、poly(G-C)的熔解过程(Cheng)发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程(Cheng)发生在一个较宽的温度范围内。Tm大小可反映出DNA的均一性。第四十三页，共七十四页。（2）G-C的含量。G-C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子(Zi)中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44第四十四页，共七十四页。（3）介质中的离子强度。Tm与介质中离子强度有关，一般来说，在离子强度低的介质中，DNA的Tm值较低，熔解(Jie)的范围较宽。在离子强度高的介质中，DNA的Tm值较高，熔解的范围较窄。DNA的保存应在含盐的缓冲液中第四十五页，共七十四页。溶液(Ye)的pH

高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力，pH大于11．3时，DNA完全变性pH低于5．0时，DNA易脱嘌呤对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加NaOH以维持变性状态第四十六页，共七十四页。变(Bian)性剂与Tm甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂第四十七页，共七十四页。影响热变性的的Tm(熔解温(Wen)度）因素（1）DNA的均一性（2）GC对含量（3）溶液的离子强度（4）溶液的pH（5）变性剂第四十八页，共七十四页。RNA变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起(Qi)的性质变化没有DNA明显第四十九页，共七十四页。质粒是原核生物和部分真核生物中独立于染色体外的自主复制的遗传分子，除酵母的杀伤质粒已知是RNA外，其它均为DNA分子。1963年Bevan等发现酵母菌株间的相互杀死现象，其嗜杀特性由具有自我(Wo)复制能力的细胞质遗传因子——双链线状RNA（dsRNA）（占全部核酸的0.1%）决定。同时dsRNA通常以蛋白质外壳包裹着的类病毒颗粒状态存在于细胞质中。目前研究表明，只有两种双链RNA与嗜杀现象有关：MdsRNA编码产生毒素蛋白及决定对自身毒素的免疫功能（90%以上），LdsRNA编码自身和外壳主蛋白（6%）第五十页，共七十四页。(2)核(He)酸的复性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。第五十一页，共七十四页。将热变性的DNA骤然冷却至低温(Wen)时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。骤然冷却变性核酸复性时需缓慢冷却，故又称退火第五十二页，共七十四页。第五十三页，共七十四页。核酸(Suan)复性动力学在一定条件下，DNA复性的速度可以用C0t1/2来衡量第五十四页，共七十四页。影响复性速度(Du)的因素(1)单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。(2)较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。(3)片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。真核DNA的重复序列就是通过复性动力学研究发现的。（4）维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度第五十五页，共七十四页。

热变性的DNA在复性过程中，具有碱基序列部分(Fen)互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化双链的现象。核酸分子杂交

(hybridization)：第五十六页，共七十四页。核酸(Suan)分子的杂交变性复性

基于核酸变性和复性的原理，并依据碱基间互补配对的原则而建立的一门技术。主要用于确定两种相同或不同的核酸分子间同源性的鉴定第五十七页，共七十四页。变(Bian)性复性复性第五十八页，共七十四页。第五十九页，共七十四页。第六十页，共七十四页。第六十一页，共七十四页。分(Fen)子杂交Southern印迹（杂交）Northern印迹（杂交）Western印迹法杂交技术与PCR技术结合，能够检出含量极低的DNA。第六十二页，共七十四页。一、单项选择题1．关(Guan)于核酸分子组成下列哪项是正确的A．组成核酸的基本单位是三磷酸核苷B.组成DNA和RNA的戊糖相同C．组成DNA和RNA的碱基是相同的D.DNA的二级结构为α-螺旋E.以上都不对2．生物体的遗传信息储存在DNA的什么部位A．碱基配对B.某个核苷酸C.某种核苷D.磷酸戊糖骨架E.碱基顺序中3．下列哪个是核酸的基本结构单位A.核苷B.磷酸戊糖C.单核苷酸D.多核苷酸E.以上都不是4．下列何物分子是C5上有甲基的碱基A.腺嘌呤B.鸟嘌呤C.胞嘧啶D.胸腺嘧啶E.尿嘧啶第六十三页，共七十四页。5．组成DNA分子的磷酸戊糖是：A.3’-磷酸脱氧核糖B.5’-磷酸脱氧核糖C.3’-磷酸核糖D.2’-磷酸核糖E.5’-磷酸核糖6．嘌呤核苷酸中下列何键是嘌呤与戊糖的连接键A.N9—C1'B.N8—C1'C.N1—C1'D.N3—C1'E.N7—C1'7．关于ATP生理功能的叙述下列哪项是错误的A.它是生物体内直接供能物质B.可生成环腺苷酸（cAMP）C.作为物质代谢调节剂D.RNA的合成原料E.以(Yi)上都不是8．核酸分子中，单核苷酸连接是通过下列何化学键A.氢键B.糖苷键C.3'，5'-磷酸二酯键D.疏水键E.盐键第六十四页，共七十四页。9．下列所述哪个是DNA分子的一级结构A.脱氧(Yang)核糖核苷酸残基的排列顺序B.各种单核苷酸的连接方式C.双螺旋结构D.连接单核苷酸间的磷酸二酯键E.以上都不是10．关于DNA二级结构的论述下列哪项是错误的A.两条多核苷酸链互相平行方向相反B.两条链碱基之间形成氢键C.碱基按A—T和G—C配对D.磷酸和脱氧核糖在内侧，碱基在外侧E.围绕同一中心轴形成双螺旋结构11．有关tRNA结构的叙述，下列哪项是错误的A.是RNA中最小的单链分子B.其二级结构通常为三叶草形C.分子中含有较多的稀有碱基D.3’末端是活化氨基酸的结合部位E.tRNA三级结构呈正“L”型12．下列哪个结构存在于真核生物mRNA5'端A.聚A尾巴B.帽子结构C.超螺旋结构D.核小体E.-C-C-A-OH顺序第六十五页，共七十四页。13．下列哪个结构存在于tRNA3'端A.聚A尾巴B.帽子结构C.超螺旋结构D.核(He)小体E.-C-C-A-OH顺序14．下列哪个结构存在于mRNA3'端A.聚A尾巴B.帽子结构C.超螺旋结构D.核小体E.-C-C-A-OH顺序15．下列何构型是溶液中DNA分子最稳定的构型A.A型B.B型C.C型D.D型E.Z型16．下列何物是在蛋白质合成中作为直接模板A.DNAB.RNAC.mRNAD.rRNAE.tRNA第六十六页，共七十四页。二、多项选择题1．下列哪些是维系DNA双螺旋的主要因素A.盐键B.磷酸二酯键C.疏水键D.氢键E.碱基堆砌作用2．rRNA具有下列哪些结构A.密码子(Zi)

B.反密码子C.反密码环D.大亚基E.小亚基3．核酸变性可观察到下列何现象A.黏度增加B.黏度降低C.紫外吸收值增加D.紫外吸收值降低E.磷酸二酯键断裂第六十七页，共七十四页。4．组成核小体的成分有A.DNAB.RNAC.组蛋白D.磷脂E.酸性(Xing)蛋白5．tRNA二级结构含有下列哪些成分A.密码子B.大亚基C.反密码环D.稀有碱基E.氨基酸结合臂6．下列物质哪些含AMP结构A.NAD+B.NADP+C.CoQD.CoAE.FAD第六十八页，共七十四页。一、单项(Xiang)选择题 1.E2.E3.C4.D5.B6.A7.E8.C9.A10.D 11.E12.B