十三章分子生物学技术

十三章分子生物学技术第1页/共42页2第十三章分子生物学技术第一节、重组DNA技术-基因工程第二节、分子杂交及相关技术第三节、聚合酶链反应的原理和应用第四节、基因定位的常用方法第2页/共42页3分子生物学技术70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。第3页/共42页4194619501955196019651970197519801985199019951944DNA是遗传物质1949Hbs贫血1953双螺旋1956HbsGlu-Val1966遗传密码第一个R酶1972重组质粒1975DNA杂交1977DNA测序1981转G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一个基因治疗1995细菌G组序列1996酵母基因组序列现代分子遗传学发展重要事件第4页/共42页5

第一节重组DNA技术-基因工程

重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技术。重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。

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一、限制酶

限制性内切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。第6页/共42页71、限制酶的命名

根据其来源命名。如：

属名菌株名

EcoRI

种名编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。第7页/共42页82、限制酶识别序列和切割形成

每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。

如：HareⅢ5’-GGCC-3’

BamHI5’-GGATCC-3`

平末端(bluntend)对称轴切，连接效果差切割形成粘性末端（stickyend）交错切。第8页/共42页9第9页/共42页10部分常用限制酶及切点第10页/共42页11互补末端连接第11页/共42页12产生相同序列的突出末端的不同片段

可有三种方式：

1)用同一种限制酶切割；2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。第12页/共42页133、特点：

根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：1)不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。2)用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。第13页/共42页14二、基因运载体及其选择

载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。第14页/共42页15载体具以下特征：1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。第15页/共42页16（一）.质粒plasmid

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

PBR322

大肠杆菌

pSC101

Plasmidchromosome

COIEIplasmid革兰氏阴性菌

pc194

scp12

真核生物-酵母质粒

第16页/共42页17常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。

EcoRIHindIIIOri复制起点LacZAPRpUC19第17页/共42页18

（二）.λ-噬菌体(λphage)是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：第18页/共42页191、置换λ载体–

溶解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。2、插入λ载体–

裂解途径

DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。第19页/共42页20裂解途径第20页/共42页21（三）.粘粒(cosmidvector)

（30～40kb）

是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30～45kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

第21页/共42页22(四)大片段DNA克隆载体

人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。第22页/共42页231、细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）

优点：能携带大片段DNA，约300kb。在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，Ecoli中的F因子。此质粒含有2种基因（partA,partB）。每个Ecoli能接受>300kbDNA片段。第23页/共42页242、噬菌体PI载体和PAC

PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。第24页/共42页253、酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）适用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb。第25页/共42页26YAC的主要功能成份有三：

1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。第26页/共42页27三、DNA重组与分子克隆化

为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。第27页/共42页28

基本原理与过程：

1、分离纯化目的基因

2、目的基因+vector=重组DNA分子

3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。

4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。

5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。第28页/共42页29分离纯化目的基因

目的基因+vector=重组DNA分子

第29页/共42页30重组DNA

和分子克隆

第30页/共42页31重组DNA和分子克隆的几种方法：

（依目的基因的来源）

1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆

3、化学合成目的基因进行克隆

4、PCR体外扩增目的片段进行克隆第31页/共42页32从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

第32页/共42页33筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cellclone）

第33页/共42页34筛查含有目的基因的细胞克隆第34页/共42页35四、目的基因表达

上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expressioncloning）.第35页/共42页36目的基因表达

第36页/共42页37（一）．真核细胞的基因在原核细胞

（细菌）中表达

原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆菌为宿主。真核多肽的表达要求：

1）适当的cDNA（完整的编码序列）；

2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；

3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。

产物特征：

1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；

2）活性受限或无活性。第37页/共42页38(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达

真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达