第四章细菌耐药性检测讲课版

第四章细菌耐药性检测伍勇中南大学湘雅三医院第一节抗菌药物种类及作用机制1.抗菌药物（antibacterialagents）指用于细菌感染性疾病治疗的药物药理学靶位不是人体组织，而是暂时或永久寄生于人体的细菌。必须符合两个方面的要求：对靶细菌有尽可能大的毒性；对人体具有尽可能大的安全性。包括抗生素（antibiotics）和化学合成的药物。2.抗生素（antibioticagents）

微生物在其代谢过程中产生的能杀灭或抑制其它特异病原微生物的产物。其分子量小，低浓度就能发挥其生物活性，有天然和人工半合成两类。。2

依据其作用靶位或抗菌药在靶位上发生的生理过程进行分类的。细胞璧的抗菌药胞质膜上的抗菌药代谢过程的抗菌药，如蛋白质合成、DNA复制或同时作用于两者。3一、抗菌药物的种类

根据抗菌药分子化学结构的不同进一步分类，同一类的抗菌药有其特定的分子作用模式。（1）作用于细菌细胞璧β-内酰胺酶类糖肽类氨基磷酸肽类（2）作用于细菌胞质膜短杆菌肽多黏菌素4一、抗菌药物的种类（3）作用于蛋白质合成及其他细胞质代谢过程氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、林可霉素类、酮环内脂类、链阳菌素、利福平、氯霉素、夫西地酸、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（4）作用于DNA复制氟喹诺酮类甲硝达唑呋喃妥因（5）辅助抗菌药的化学物质β-内酰胺酶抑制剂5一、抗菌药物的种类图1革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁的结构本图重点描述革兰阳性菌和革兰阴性菌外部结构的主要不同（不包括脂多糖，该组分占革兰阴性菌外膜的45％，替代了其外表面的磷脂）（一）作用于细菌细胞璧的抗菌药细菌细胞璧结构6二、抗菌药物的作用机制肽聚糖合成过程中的关键步骤细胞浆内：合成N-乙酰胞壁酸-五肽细胞膜上：合成N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸-五肽-磷脂细胞膜外：完成肽聚糖的交叉连接7二、抗菌药物的作用机制肽聚糖合成过程中需要的酶（PBP）转糖基酶：催化β-1，4糖苷键形成转肽酶：使N-乙酰胞壁酸-五肽脱去末端的D-丙氨酸，与另一条肽链的肽桥（五肽交联桥）交联，形成三维网状结构。羧肽酶：催化五肽末端D-丙氨酸水解内肽酶：催化水解已合成肽聚糖上的肽键细菌生存必需的是转肽酶和转糖基酶8二、抗菌药物的作用机制

与青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制肽聚糖合成中所需的转肽酶，阻止肽聚糖链的交叉连接，干扰细胞壁合成。繁殖期杀菌药9二、抗菌药物的作用机制10抑制细胞壁粘肽的合成青霉素的母核11二、抗菌药物的作用机制1.β-内酰胺类抗菌药的作用机制（1）β-内酰胺类的细菌穿透能力β-内酰胺类抗菌药大部分为水溶性的，难以穿过富含脂质的细胞膜。但其PBP靶位点位于胞质膜的外侧，所以，细胞壁为其穿透细菌唯一障碍。肽聚糖不是β-内酰胺类抗菌药的穿透障碍，这类抗菌药很容易进入革兰阳性细菌。在革兰阴性菌的外膜上常有多种类型的膜孔蛋白，成为亲水性β-内酰胺类的优先通道。

12二、抗菌药物的作用机制（2）β-内酰胺类PBPs之间的相互作用：β-内酰胺类的作用位点包括参与肽聚糖合成的转肽酶、羧肽酶、转糖基酶等PBPsβ-内酰胺类与这些酶共价结合抑制肽聚糖的合成，中止了细菌的生长。13二、抗菌药物的作用机制14β-内酰胺类抗菌药青霉烷类甲氧青霉烷类替莫西林青霉素类青霉素G、青霉素V、甲氧西林、羧基类青霉素、脲基类青霉素类、氨基类青霉素类氧青霉烷类克拉维酸碳青霉烷类青霉烯类氧青霉烯类碳青霉烯类亚胺培南、美罗培南硫青霉烯类头孢烯类氧头孢烯类拉氧头孢头孢菌素类I代头孢菌素II代头孢菌素：头孢孟多、头孢呋辛III代头孢菌素：头孢噻腭、头孢他啶、头孢曲松广谱头孢菌素：头孢吡腭、头孢匹罗头霉素类头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑碳头孢烯类单环内酰胺类诺卡菌素单环菌素类氨曲南单环磷胺类MonocabamsMonosulphactamsG+G-好差好差2.糖肽类抗菌药的作用机制糖肽类包括万古霉素和替考拉宁，它们抑制糖基转移酶和转肽酶而抑制肽聚糖的合成。糖肽类杀菌作用缓慢。对革兰阴性菌是无效的，因为该类抗菌药太大，不能通过膜孔蛋白扩散进入革兰阴性菌。3.磷霉素的作用机制磷霉素作用于肽聚糖的起始阶段，即细胞质阶段。它可通过膜孔蛋白穿入外膜，由于其分子小，可很容易地穿过肽聚糖。15二、抗菌药物的作用机制（二）作用于蛋白质或核酸合成的抗菌药

这些抗菌药被列在同一组是因为它们的作用位点都在细胞质中。1.氨基糖苷类药物的作用机制（1）

对细菌的穿透作用氨基糖苷类在细菌周围高浓度聚集，可通过膜孔蛋白快速穿透细菌的细胞壁。不管是革兰阴性菌还是革兰阳性菌，氨基糖苷类都很容易穿过肽聚糖。（2）效应阻止蛋白质的合成和破坏胞质膜的完整性抑制DNA的复制16二、抗菌药物的作用机制2.喹诺酮的作用机制（1）对细菌的穿透作用喹诺酮是亲水的小分子易穿过肽聚糖可通过膜孔蛋白进入革兰阴性菌中喹诺酮可非常快地经胞质膜扩散入胞质中（2）效应喹诺酮可快速抑制DNA的合成，从而导致细菌的死亡。17二、抗菌药物的作用机制3.大环内酯类、林可霉素、链阳霉素、酮环内酯类抗菌药的作用机制这些抗菌药的化学性质十分不同，但它们有相似的抗菌谱和作用靶。它们都是与50S亚单位上的23rRNA结合，通过阻止肽链的转位或转移来抑制肽链的延长的。4.其他抗菌药的作用机制（见下表）18二、抗菌药物的作用机制抗菌药作用机制效应利福平制止依赖DNA的mRNA多聚酶（形成游离基？）阻止蛋白质合成的起始（先抑菌后杀菌）硝基咪唑切割DNA链（形成游离基，螺杆菌属和加德诺菌属）（杀菌性）四环素与30S核糖体亚单位结合抑制肽链的延长（抑菌性）氯霉素与50S核糖体亚单位的23SrRNA结合抑制肽链的延长（抑菌性）夫西地酸稳定核糖体－EF①－GDP复合物抑制肽链的延长磺酰胺甲氧苄啶磺胺复合药抑制DHPS②抑制DHFR③抑菌性抑菌性杀菌性噁唑酮类抑制蛋白质的合成对肠球菌和葡萄球菌为抑菌性，对链球菌为杀菌性注：①EF：延长因子；②HDPS：二氢蝶酸合成酶；③DHPR：二氢乙酸合成酶。二、抗菌药物的作用机制（三）抗分枝杆菌的抗菌药1.抗结核分枝杆菌的分子活性根据抗菌活性和对人体的毒性作用，抗结核药物可分为两类。一线药：链霉素、利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。二线药：乙硫异烟肼、脱氧环丝氨酸、卷曲霉素、对氨基水杨酸（PAS）和氟喹诺酮。

20二、抗菌药物的作用机制2.抗非典型分枝结核杆菌除了堪萨斯分枝杆菌对抗结核治疗效果好以外，其他非典型分枝杆菌对大部分抗结核的抗菌药都表现为耐药。3.抗结核药物的作用机制（1）一线药物异烟肼：活性衍生物阻止分枝杆菌合成和促进氧自由基生成。利福平：通过抑制DNA依赖mRNA聚合酶rpoB编码亚基从而影响转录，它有杀菌作用。21二、抗菌药物的作用机制乙胺丁酸：能通过干扰阿拉伯半乳糖（分枝杆菌细胞壁的一种主要成分）的合成来阻止分枝杆菌细胞壁的形成。链霉素：能结合核糖体30S亚基的成分来干扰蛋白质的合成。（2）二线药物乙硫异烟肼：与异烟肼的结构和作用途径相似，抑制结核复合物中的细菌。对氨基水杨酸（PAS）：能抑制叶酸的合成而起到抑菌作用。环丝氨酸：对大多数分枝杆菌有效，能抑制肽聚糖的合成。卷曲霉素：能结合核糖体30S和50S亚基，干扰蛋白质的合成。22二、抗菌药物的作用机制抗菌药物的作用机制23抗菌药物的主要作用部位喹诺酮类林可霉素类氨基糖苷类酮康唑环丝氨酸利福平红霉素制霉菌素杆菌肽甲氧苄胺嘧啶四环素类两性霉素B万古霉素磺胺药氯霉素多粘菌素类β-内酰胺类抑制核酸合成核糖体细胞膜细胞壁24抗菌药物敏感试验（antimicrobialsusceptibilitytest，AST）：指体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。AST意义：预测抗菌治疗的效果指导临床选择用药发现或提示细菌耐药机制进行耐药菌监测评价新药的效果25第二节抗菌药物敏感性试验一、抗菌药物选择A组常规首选药物，全部报告B组医院感染重要药物，选择性报告C组用于A、B组耐药或过敏的患者U组用于尿道分离细菌O组一般不允许常规试验并选择的药物26第二节抗菌药物敏感性试验常用方法1.纸片扩散法—K-B纸片法2.稀释法肉汤稀释法：宏量、微量琼脂稀释法3.抗菌药物梯度法—E-test4.自动化仪器法27第二节抗菌药物敏感性试验二、纸片扩散法（K-B法）（一）实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含有的药物溶解后向周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关28第二节抗菌药物敏感性试验（二）培养基和抗菌药物纸片1.抗菌药物纸片专用药敏纸片：直径-6.35mm

吸水量-20微升2.培养基水解酪蛋白（M-H）琼脂，琼脂厚度4mm链球菌属、肠球菌属、脑膜炎奈瑟菌：加5%脱纤维羊血嗜血杆菌属：Ⅴ、Ⅹ因子纸片扩散法293.菌液比浊管-0.5麦氏比浊管的制备：1%氯化钡：0.5ml1%硫酸溶液：99.5ml625nm处吸光度值为0.08~0.10，相当于1.5×108cfu/ml用前混匀有效期：6个月纸片扩散法30（三）实验方法1.校正菌液浓度无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落，置于无菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管校正菌浓度。纸片扩散法31纸片扩散法2.接种细菌-涂布法用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。32纸片扩散法333.贴药敏纸片室温干燥3~5min各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。纸片扩散法344.读取试验结果经过35℃16～24h孵育，量取抑菌圈直径。纸片扩散法35（四）结果判读和报告1.敏感（S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后所达到的血药浓度所抑制或杀死2.中介（I）：提高药物浓度或药物浓集部位有效。意义不确定3.耐药（R）：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，且不管其剂量大小或细菌所在部位纸片扩散法36（五）质量控制1.菌液浓度：0.5麦氏比浊2.培养基：M-H琼脂，厚度为4mm3.质控菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等ATCC:AmericanTypeCultureCollection纸片扩散法374.培养要求大部分需氧菌：（35±2）℃，空气培养，16~18h；不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽窄食单胞菌：（35±2）℃，空气培养，20~24h；嗜血杆菌属：（35±2）℃，5%CO2，16~18h；链球菌属和奈瑟菌属的培养时间为20~24h；淋病奈瑟菌：（36±1）℃（不能超过37℃），5%CO2，20~24h

葡萄球菌检测对甲氧西林、苯唑西林、奈夫西林和万古霉素敏感性时培养时间必须延长至24h（金葡为18h）且温度不超过35℃；检测肠球菌对万古霉素的敏感性时，必须延长培养时间至24h。

纸片扩散法38三、稀释法（一）肉汤稀释法有宏量稀释法和微量稀释法原理：以M-H液体培养基将抗菌药物做不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度(MBC)。MIC：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：μg/ml

或U/mlMBC：抗菌药物能够杀灭99.9%接种菌所需要的最低浓度39第二节抗菌药物敏感性试验1.

培养基离子校正M-H肉汤（CAMHB）：Ca2+、Mg2+2.

药物稀释（1）配制抗菌药物原液：1000μg/ml重量（mg）=溶剂（ml）×浓度（μg/ml）/药物效价（μg/mg）体积（ml）=重量（mg）×药物效价（μg/mg）/浓度（μg/ml）稀释法40例：需配制100ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg，需要精确称取抗生素粉剂的量为多少？重量=100×1280÷750=170.7mg（2）稀释抗菌药物的制备抗菌药物终含量：128、64、32……0.25μg/ml原液10倍稀释备用稀释法413.菌液菌液的准备：0.5麦氏比浊标准（同纸片法）最终菌液浓度：5×105CFU/ml4.实验方法1）抗菌药物稀释：取试管10支，另取3支标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”、“质控菌生长对照”。除第1管外每管加肉汤2ml，1、2号管加待测最高浓度药液（128μg/mg

）2ml，依次对倍稀释至10管。2）测试菌的准备：0.5麦氏比浊标准，10倍稀释3）接种细菌：取0.1ml待测菌依次由低浓度到高浓度加到10支管中。4）孵育：35℃孵育16~18h稀释法425.结果判读以肉眼观察无菌生长管为最低抑菌浓度（MIC）结果报告：MIC（μg/ml）稀释法43446.质量控制（1）细菌终浓度：5×105CFU/ml（2）基础培养基：离子校正的MH肉汤苛养菌：加入必要的补充物质（3）质控菌株：同纸片法稀释法45微量稀释法46第二节抗菌药物敏感性试验（二）琼脂稀释法

原理将待测菌接种于含不同浓度的抗菌药物的琼脂平板上。经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。47优点比液体稀释法重复性好每个平板同时可测定多株细菌可观察被检菌集落生长良好与否可发现污染菌落第二节抗菌药物敏感性试验1.培养基：M-H琼脂2.含药琼脂的制备配制抗菌药物原液稀释抗菌药物加到融化MH琼脂中贮存日期：5天接种菌液的准备0.5麦氏标准，10倍稀释3.

细菌接种（1）画格编号（2）点种待测菌：1～3μl/格,直径5～8mm

（104CFU/点）（3）培养18～24h观察结果琼脂稀释法484.结果判读先读质控平板的MIC，再读待检菌平板的MIC；在前后二个不同梯度浓度的抗生素M-H琼脂平板上，细菌生长数量由80%～90%突然减少为结果终点，即MIC值。结果报告：MIC（μg/ml）或敏感（S）、中介(I)、耐药(R)琼脂稀释法49四、E试验结合了稀释法和扩散法的原理和特点操作简便同扩散法可以直接定量出测试药物对测试菌的MIC50第二节抗菌药物敏感性试验（一）原理

E试条是一条5mm×50mm，内含有一系列预先制备的、浓度呈连续指数增长稀释抗生素。将E试条放在接种细菌的平板上，孵育过夜，出现椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑菌浓度（IC）。（二）培养基

M-H琼脂（三）细菌接种和加样1.接种菌准备、平板接种：同扩散法2.用E试验加样器或镊子将试条放在接种细菌的平板表面，试条刻度面朝上。150mm平板：可放6条90mm平板：1~2条E试验51（四）结果判断和报告读取椭圆环和E试带交界点的IC值1.带两侧的抑菌圈与试条相交在同一点，读取相交处的刻度数值。2.带两侧的抑菌圈与试条相交处位于试条上所示上下两刻度之间时，读取较高的刻度值。3.带两侧的抑菌圈与试条相交处不一致时，读取刻度值较高的一侧所示的读数。4.沿带边缘生长的纤细菌线可忽略不计。5.在椭圆形抑菌圈与试条相交处或圈内有小菌落或大菌落时，应读生长被完全抑制的部分与试条相交处的读数。E试验52五、联合药物敏感试验（一）联合药敏试验意义1.目的：用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗治疗多种细菌引起的混合性感染预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生可以减少用药剂量对于某些耐药菌可取得协同抗菌效果53第二节抗菌药物敏感性试验五、联合药敏试验2.结果与类型无关作用:两种药物联合作用的活性等于其单独活性。拮抗作用：两药联合作用显著低于单药活性累加作用：两种药物联合作用的活性等于其单独活性之和。协同作用：两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。54第二节抗菌药物敏感性试验（二）联合抑菌试验1.单药纸片搭桥法——定性试验两种含药纸片贴于含菌琼脂表面，药物联合对被检菌作用可出现不同的图形。根据图形解释结果。两种药物间距：3~4mm55第二节抗菌药物敏感性试验单药纸片搭桥法56第二节抗菌药物敏感性试验2.棋盘稀释法——定量试验（1）原理将甲乙两药的各种稀释度加以组合，组成联合药敏管。同时两种药物每一稀释度都有一只加单一药物的单独药敏管。根据单一药物对被检菌的MIC和联合药敏管中的抑菌情况，可精确测定两药在适当浓度比例下所产生的相互作用。（2）试验步骤1）确定单药的MIC2）确定联合药敏的药物稀释度每一稀释度浓度为联合药敏管内所需单药终浓度的2倍用MH液体培养基将甲乙两药稀释6~8个稀释度57第二节抗菌药物敏感性试验3）棋盘状排列无菌试管排列6排无菌试管，每排6支4）加甲、乙两药（分别从横、竖排加入）每管各1ml，横排和纵排的第一管为无药对照，第一排为单药对照管5）加待测菌液各管加入被检菌液0.01ml菌液终浓度：105CFU/ml58第二节抗菌药物敏感性试验32/032/0.532/132/232/432/816/016/0.516/116/216/416/88/08/0.58/18/28/48/84/04/0.54/14/24/44/82/02/0.52/12/22/42/80/00/0.50/10/20/40/8甲药稀释乙药稀释例：甲药MIC单独16mg/L

乙药MIC单独4mg/L59第二节抗菌药物敏感性试验结果判读FIC：部分抑菌浓度指数甲药联合时MIC乙药联合时MICFIC=+

甲药单独时MIC乙药单独时MICFIC<0.5协同作用

0.5~1.0相加作用

1~2无关作用

>2拮抗作用

60第二节抗菌药物敏感性试验------------++++--++++--++++--++++--32168420甲药浓度

00.5

1248乙药FIC=8/16+4/4=1.561第二节抗菌药物敏感性试验------+-----++----+++---++++--+++++-32168420甲药

00.5

1248乙药62第二节抗菌药物敏感性试验FIC=4/32+2/8=0.375FIC=8/32+1/8=0.375第三节细菌的耐药机制及其检测细菌的耐药性：对某种药物敏感细菌变成对该药物耐受机制产生耐药酶：水解酶、钝化酶等药物作用的靶位点改变细胞膜的通透性改变细菌主动外排

63一、产生药物灭活酶（一）水解酶-β-内酰胺酶是以β-内酰胺类抗菌药物为水解底物的多种同类型的降解酶。包括广谱内酰胺酶、超广谱酶β-内酰胺（ESBLs）、金属酶、AmpC酶等细菌产生的β-内酰胺酶可特异性打开β-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性。ESBLs阳性菌：对所有β-内酰胺类药物耐药64第三节细菌的耐药机制及其检测（二）钝化酶产生1.氨基糖苷类钝化酶2.氯霉素乙酰转移酶3.红霉素和其他灭活酶（三）修饰酶（氨基糖苷类修饰酶）1.乙酰转移酶AAC2.核苷转移酶ANT3.磷酸转移酶APH65第三节细菌的耐药机制及其检测66第三节细菌的耐药机制及其检测67第三节细菌的耐药机制及其检测1.青霉素结合蛋白改变2.DNA解旋酶改变二、药物作用靶位的改变68三、抗菌药物渗透障碍外膜蛋白减少四、药物的主动转运系统外排作用第三节细菌的耐药机制及其检测五、耐药表型检测方法常用方法：1.β内酰胺酶检测2.超广谱β内酰胺酶纸片法检测3.AmpC酶的检测4.碳青霉烯酶检测5.耐甲氧西林葡萄球菌检测6.克林霉素诱导耐药试验7.VISA和VRSA检测8.肠球菌高水平氨基糖苷类和万古霉素耐药检测9.青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）检测69第三节细菌的耐药机制及其检测β

-内酰胺酶β-内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中。检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。黄色纸片变红为β-内酰胺酶阳性。70五、耐药表型检测方法

葡萄球菌属——青霉素

方法敏感中介耐药MIC0.12g/ml-0.25g/ml纸片扩散法29mm-28mmCLSIM100-S20.Table2C.71五、耐药表型检测方法诱导β-内酰胺酶的检测如果青霉素的药敏结果出现以下情况，需要做诱导β-内酰胺酶的检测：MIC≤0.12µg/mlZonediameter≥29mm

诱导β-内酰胺酶试验苯唑西林(诱导剂)接种纯菌落于琼脂上(例如，BAP,MHA)；贴ß-内酰胺类纸片(例如,苯唑西林,头孢西丁)；孵育过夜；测试抑菌圈周围的细菌；如果β-内酰胺酶阳性,报告青霉素R。PosNeg72五、耐药表型检测方法超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制；ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。73五、耐药表型检测方法超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）纸片法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBLs（筛选阳性）：头孢泊肟≤17mm头孢他啶≤22mm头孢噻肟≤27mm头孢曲松≤25mm氨曲南≤27mm74五、耐药表型检测方法纸片法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差≥5mm时，即可判断该菌产ESBL。75五、耐药表型检测方法超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL：头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL或头孢泊肟MIC≥8mg/mL76五、耐药表型检测方法超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）稀释法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。

77五、耐药表型检测方法超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）AmpC酶的特征AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的Ⅰ型β内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。78五、耐药表型检测方法头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、头孢西丁琼脂基础法等。79五、耐药表型检测方法AmpC酶的特征头孢西丁纸片大肠杆菌标准菌株（对头孢西丁敏感）碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的β-内酰胺酶，主要分布于β-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类β-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类β-内酰胺酶。80五、耐药表型检测方法碳青霉烯酶A类酶B类酶D类酶染色体编码：SMENMCIMI质粒编码：KPCGES质粒编码OXA-23OXA-24OXA-51OXA-58OXA-55OXA-48OXA-50OXA-60OXA-62金属酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制剂抑制可以被EDTA抑制81五、耐药表型检测方法82碳青霉烯酶表型检测方法—改良hodge试验ATCC25922，0.5麦氏，1:10稀释涂MH平板平皿中心贴10μg厄他培南或亚胺培南纸片10μl环挑取3～5个菌落从平板中心纸片边缘向平板边缘划线被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强，即产碳青霉烯酶。五、耐药表型检测方法改良hodge试验的结果判读83五、耐药表型检测方法84金属酶表型检测方法：EDTA协同试验用0.5麦氏单位的待测菌悬液涂布MH平板。贴IMP(10μg)纸片．距其1cm处贴EDTA纸片（0.5mol/L4μl）。35℃过夜培养。亚胺培南抑菌圈在靠近加EDTA纸片侧明显扩大者为产金属酶菌株。亚胺培南EDTA10mm五、耐药表型检测方法

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的β-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。

SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不同mec复合物和ccr复合物的组合，可以将SCCmec分成不同的型别，目前已发现8种SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌85五、耐药表型检测方法86SCCmec基因盒五、耐药表型检测方法耐甲氧西林葡萄球菌的检测MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。87五、耐药表型检测方法甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS）MRS检测药物纸片法稀释法金黄色葡萄球菌1mg苯唑西林√√路邓葡萄球菌1mg苯唑西林×√金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌30mg头孢西丁√√除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌1mg苯唑西林×√30mg头孢西丁√×88五、耐药表型检测方法凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略*苯唑西林MIC(µg/ml)进行mecA或PBP2a或头孢西丁纸片扩散≤0.25≥4.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药阴性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株89五、耐药表型检测方法克林霉素诱导耐药葡萄球菌红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯类90五、耐药表型检测方法机制耐药基因红霉素克林霉素核糖体修饰-药物不能结合于靶位ermRS*RR结构性泵-药物被泵出msrARSerm =erythromycinribosomemethylasemsrA =macrolidestreptograminresistance*需要诱导来显示耐药性

红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制91五、耐药表型检测方法诱导性克林霉素耐药（erm介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（msrA介导）真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感“D”阳性阴性15～26mm92五、耐药表型检测方法葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法4.0 µg/ml红霉素0.5 µg/ml克林霉素Nogrowth=无诱导性克林霉素耐药生长=诱导性克林霉素耐药93五、耐药表型检测方法对于红霉素耐药，克林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药注意试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株)；对于CoNS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的；大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA基因型)；克林霉素可以口服给药。94五、耐药表型检测方法万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌（VISA）耐药是由于：增厚的细胞壁检测困难；表型不稳定菌落形态不典型金葡菌万古霉素敏感万古霉素中介细胞壁95五、耐药表型检测方法MRSA(notVISA)VISA血琼脂上48小时生长96五、耐药表型检测方法当有以下一个或多个情况时菌株可疑为VISA-內酰胺类药物的MIC降低达托霉素MIC升高菌落形态不典型（一些为微小菌落）肉汤中生长迟缓（如血培养）凝固酶反应微弱/延迟经过几次次代培养后：菌落回复为典型形态万古霉素MIC降低并且菌株变为万古霉素敏感97五、耐药表型检测方法万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA）耐药是由于从万古霉素耐药肠球菌（VRE）中获得vanA基因美国报道例数9个患者检测大多数标准方法均可检测菌落形态典型金葡菌98五、耐药表型检测方法vanA从VRE转至金葡菌vanA99五、耐药表型检测方法纸片扩散法折点：葡萄球菌-万古霉素CLSI文件Susceptible敏感Intermediate中介Resistant耐药M100-S18200815--New!新M100-S192009*---CLSIM100-S19.Table2C.对于金黄色葡萄球菌*假如抑菌圈≥7mm，用MIC法检测万古霉素（若有需要）万古霉素纸片扩散法仅在检测携带van-A金葡菌（VRSA）时可信；需确证没有抑菌圈(≤6mm)

纸片扩散法不能鉴别VSSA和VISA纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌100五、耐药表型检测方法肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查纸片扩散法120µg庆大霉素;300µg链霉素

10mm=无高水平氨基糖苷类耐药MIC筛查庆大霉素:500µg/ml链霉素:1000µg/ml(肉汤) 2000µg/ml(琼脂)101五、耐药表型检测方法肠球菌氨基糖苷类修饰酶

链霉素庆大霉素妥布霉素阿米卡星/丁胺卡那6-AAD