生物技术在植物育种中应用市公开课金奖市赛课一等奖课件

第十三章生物技术在植物育种中应用

第1页第1页

1、教学基本要求

（1）理解细胞工程与作物育种原理和基本办法；

（2）理解作物转基因技术原理和基本办法；

（3）理解分子标识主要类型和分子标识辅助选择育种原理和基本办法。第2页第2页2、教学基本内容

第一节细胞工程与作物育种

一、细胞和组织培养与作物育种

二、植物原生质体培养和体细胞杂交

第二节作物育种转基因技术

一、转基因技术发呈现实状况

二、*转基因育种程序

三、转基因作物品种选育

四、转基因作物生物安全性

第三节分子标识辅助选择育种

一、*分子标识类型和特点

二、惯用分子标识原理和遗传特性

三、MAS育种办法第3页第3页第十三章生物技术在作物育种中应用

第一节细胞工程与作物育种第4页第4页植物细胞工程（plantcellengineering）是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（invitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学特性按人们意愿生产某种物质过程。第5页第5页细胞工程与作物遗传改良有着密切关系，利用细胞工程技术已哺育出一些大面积推广品种。第6页第6页

早期，哈布兰特在前人细胞学说影响下，提出高等植物组织和器官能够不断分割，并进一步提出了植物细胞全能性（celltotipotency）理论。第7页第7页

植物细胞全能性是植物细胞工程理论基础。细胞全能性是指细胞所含有形成各种细胞类型潜在能力，也包括植物细胞经脱分化再形成植株能力。第8页第8页19，Hanning用萝卜胚培养，取得小植株，为组织培养工作奠定了基础。第9页第9页1934年，White对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长无性繁殖系，取得了离体培养真正成功。

三年后，White又发觉B族维生素对培养物生长有主要作用。第10页第10页

通过几年努力，以White为主几位科学家建立了植物组织培养（plainttissueculture）综合培养基，成为以后各种培养基基础。第11页第11页

1948年，Skoog等发觉腺嘌呤/生长素百分比是控制芽和根分化决定原因之一，这一发觉成为植物组织培养中控制器官形成激素模式。

Miller（1956）发觉激动素比腺嘌呤更能增进芽形成。

第12页第12页1958年，Stewart&Shautz从胡萝卜根悬浮细胞诱导分化成完整小植株，使50多年前哈布兰特提出细胞全能性假说初次得到科学验证，这一结果大大加速了植物组织培养研究发展。

1964年，Guha等从曼佗罗花药培养出单倍体植株。

第13页第13页1970年，Kameya等利用花粉培养取得单倍体植株。

1971年，Takebe等初次从烟草原生质体取得再生植株；

1972年，Carlson等取得第一个烟草种间体细胞杂种植株。第14页第14页

至此，在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都取得了完整植株，充足证实了植物细胞全能性。

植物组织培养流程示意图下列。第15页第15页

外植体起源→外植体培养→

愈伤组织

→再生小植株→再生植株

第16页第16页植物细胞工程应用在20世纪60年代就已受到注重，但真正应用研究在70年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随后又育成了一些水稻、小麦新品种。第17页第17页经济植物快繁与脱毒、体细胞变异筛选、新种质创造、细胞器移植、DNA导入等均对作物改良和农业生产起到了增进作用。第18页第18页一、植物细胞和组织培养技术第19页第19页（一）培养基及其构成

第20页第20页1、培养基（Medium）种类和特点

惯用培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。第21页第21页2、培养基成份

培养基中都应包括植物生长必需16种营养元素和一些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无机营养物、有机物质和植物生长调整物质（表）。

第22页第22页表

植物组织培养所需养分和激素

水↑

有机物

大量元素

微量元素

PH

糖NFeCo↓

氨基酸PZnNi

维生素KBAl

生长素CaMnMo

细胞分裂素MgCuI

调整物质

赤霉素S

脱落酸

乙烯

酵母提取物

椰子汁

成份不定物质

植物提取物

水解酪蛋白

蛋白胨第23页第23页（二）培养基配制

第24页第24页1、母液配制

为了减少配制培养基时每次称量药物麻烦，减少极微量药物在每次称重时误差，普通先配制高浓度储备液，即母液。第25页第25页

大量元素可配成10倍母液，使用时每配制1000ml培养基需要从母液中取100ml。配制母液时应做到分别称量，充足溶解，在混合顺序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。第26页第26页

微量元素由于使用量低，普通配成100倍甚至1000倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10ml或1ml，配制时应注意充足溶解后再依次混合。第27页第27页

第三种母液即铁盐，铁盐必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀。普通采用鳌合铁，即FeSO4与EDTA钠盐混合物，普通扩大200倍。第28页第28页

EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75~80℃之间让其鳌合1h。使用鳌合铁目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe+。第29页第29页第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独母液，浓度为每毫升含0.1、1、10mg，使用时依据需要量取。第30页第30页

最后一个母液是激素，每种激素应单独配制母液，其浓度为0.1、0.5或1.0mg/ml。各种激素难溶于水，配制时应注意溶解顺序。第31页第31页

IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少许95%酒精，再加水定容；NAA可溶于热水或少许酒精后，再加水定容；2，4-D不溶于水，可用1molNaOH溶解后再定容；KT和BA应先溶于少许1molHCl中，然后定容。第32页第32页表

一些植物组织培养基成份（mg/L）

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

大量元素

NH4NO31650--1650--720----16501200

KNO319002527.51900809502500--19001900

CaCl2•2H2O440150------20075440440

CaCl2----440--166--------

MgSO4•7H2O370246.5370750185400250370370

KH2PO4170--170--68----170340

NH4H2PO4----------340------

（NH4）2SO4--134--------------

Ca（NO3）2•4H2O------300----------

NaNO3------------600----

NaH2PO4•H2O--150--19----125----

KCl------65----750----

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------第33页第33页------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

微量元素

KI0.830.753.320.75--10.010.83--

H3BO36.2324.81.510516.20.63

MnSO4•4H2O22.3--89.2525--0.122.32.23

MnSO4•H2O--10------10------

ZnSO4•7H2O8.6234.4310118.6--

ZnSO4•4H2O------------------

Zn•Na2•EDTA----------------15

Na2MoO4•2H2O0.250.251.0--0.250.1--0.250.025

MoO3------0.001----------

CuSO4----------0.2------

CuSO4•5H2O0.0250.0250.10.010.025--0.030.0250.0025

CoCl2•6H2O0.0250.0250.1----0.1--0.0250.0025

CoSO4•7H2O------------0.03----

AlCl3------------------

NiCl2•6H2O------------0.03----

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------第34页第34页---------------------------------------------------------------------------------------------------------

铁盐成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

--------------------------------------------------------------------------------------------------------FeCl3•6H2O------------1----

Fe2(SO4)3------2.5----------

FeSO4•7H2O27.8--27.8--27.815--27.827.8

Na2EDTA•2H2O37.3--37.3--37.320--37.337.3

NaFe•EDTA--28--------1----

--------------------------------------------------------------------------------------------------------第35页第35页成份MS①B5ORWhiteNitschSH②HellerLS③ER

有机物

盐酸吡哆醇0.5110.010.50.5----0.5

盐酸硫胺素0.110130.010.55--0.40.5

烟酸0.5110.0555----0.5

肌醇100100100--1001000--100--

甘氨酸2----32------2

脯氨酸----1381------------

叶酸--------0.5--------

生物素--------0.05--------

蔗糖3%2%3%2%2%3%--3%4%

第36页第36页2、培养基配制

以配制1L培养基为例，培养基配制办法下列：

第37页第37页

⑴

混合各成份母液。取大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、铁盐母液5ml于一个1L烧杯中，依次加入有机成份和激素，并加水至500ml。第38页第38页

⑵熔化琼脂：称7~8g琼脂和所需蔗糖于另一1L烧杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加热使琼脂充足熔化。第39页第39页

⑶将（1）和（2）混合，搅拌均匀，补水至1000ml。第40页第40页⑷调PH。普通用0.1molNaOH或1NHCl调PH至所需PH。普通PH调至5.8，但也有PH调到7.0，不同材料最适PH不同。对培养基凝固来说，PH较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸取营养；PH过低，低到4.0以下时，培养基极难凝固。第41页第41页

⑸分装：将培养基分装于100ml或50ml三角瓶中，每瓶50或30ml左右，封口包装。第42页第42页

⑹灭菌：普通用1.1kg/cm2压力，在121℃下灭菌15~20min。灭菌时间应依据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；时间长，会引起培养基成份降解。第43页第43页

⑺放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上，使之冷却凝固。培养瓶应平放，以免形成斜面。第44页第44页（三）无菌操作办法

第45页第45页1、消毒剂

在接种前，必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功基本确保。要确保这一点，取材时应选取植物组织内部无菌材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严格预防病虫。第46页第46页应在晴天取材，最好中午或下午取材。最好避免选取田间材料，选取无菌苗较好。非要用田间材料时，为避免消毒困难，可将材料种在大棚或生长箱里。惯用消毒剂见表。第47页第47页表

植物材料消毒惯用消毒剂及使用办法

----------------------------------------------------------------------

消毒剂

使用浓度消除难易

消毒时间消毒效果

（%）

（min）

----------------------------------------------------------------------

次氯酸钠2易5~30较好

次氯酸钙9~10易5~30较好

漂白粉

饱和溶液

易5~30较好

氯化汞0.1~1.0较难2~10最好

酒精 70~75 易 0.2~2 好

H2O2 10~12 最易5~15好

溴水 1~2 易 2~10较好

AgNO3 1较难5~30好

抗生素4~50mg/L中30~60 较好

第48页第48页对于难消毒材料，如有茸毛、粗糙不平材料等，在消毒前，普通先用肥皂水洗，自来水冲净，在70%酒精或1LHCl中浸30s，再加入消毒剂。不同材料消毒方式和所需时间不同，研究者应依据不同材料确定详细消毒方案。第49页第49页2、无菌操作

准备好接种材料用培养基、待消毒材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、70%酒精等。第50页第50页

将超净工作台打开，让其运营10min左右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料烧杯中，5~10min后取出另一盛有无菌水烧杯中，无菌水冲洗3~4次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。第51页第51页无菌操作时应注意下面几个问题：整过操作过程一切用具必须一直保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用70%酒精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽也许避免手再从其上横过；避免强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。第52页第52页3、无菌培养

材料接种后移入培养室培养，普通培养室要求非常卫生，恒温，有抱负光照控制系统，普通材料要求25℃左右，晚上普通不低于20℃。第53页第53页二、

细胞和组织培养与作物育种第54页第54页（一）

体细胞克隆变异及其育种利用

第55页第55页在近50年中，以植物组织培养为基础生物技术研究与发展为植物育种提供了一些新试验办法和手段，并且培养出一些在生产上有利用价值品种。第56页第56页

体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生变异。Larkin等（1981）在其综述文章中开始使用“体细胞克隆变异”（somaclonalvariation）这一概念。第57页第57页为了区别起源于体细胞和单倍体细胞变异，Evans未来自配子体组织变异称为“配子体克隆变异”（gametoclonalvariation），以与体细胞克隆变异区别开。第58页第58页对于遗传变异分析而言，Orton为了统一术语，引进了R0、R1、R2等，分别表示再生当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。

第59页第59页

1、体细胞克隆变异遗传基础

（1）染色体数目变异

最多见是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素。第60页第60页

变异大小与培养状态、年龄、原始材料倍性及培养时期相关。研究发觉：二倍体变异频率随培养时间延长而减少，四倍体变异频率却随培养时间延长而增长。第61页第61页（2）染色体结构变异

染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异主要起源，最主要是染色体缺失、倒位、重复和异位。诸多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充足阐明了染色体结构变异存在。第62页第62页（3）点突变

这类突变可分为各种类型，一个类型是自发突变，最早证实点突变存在是从烟草中利用体外筛选取得抗chlorsulfuron突变体。诸多通过细胞筛选取得抗病、抗除草剂等突变体属于这类。第63页第63页

另一个点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。由于培养过程中，培养物始终处于诱变环境条件下，因此突变终归是自发还是诱发很难弄清楚。第64页第64页第三种点突变是基因表示及基因放大或衰减。高等植物一些基因在发育过程中受到某一环境刺激，能够放大自己，即基因拷贝数大量增长，这意味着该基因转录mRNA及蛋白质增长。最初在动物细胞培养中发觉这一现象，以后在植物中发觉也存在。第65页第65页比如，对某一物质抗性，能够通过逐步增长浓度办法而使细胞对该物质抗性提升诸多倍，这就是基因放大系统存在较好例证。同样，也发觉植物细胞DNA丢失（衰减），如大豆悬浮系通过较长时间培养，其核糖体基因丢失了1/3。第66页第66页第四种点突变是有丝分裂互换。这种互换尽管很微弱地改变了基因顺序，但仍影响基因表示。这种改变包括：某一基因拷贝丢失，某一基因拷贝重复或修复过程中基因转变。第67页第67页转座因子也是造成体细胞突变原因之一，转座子通过插入与解离使一些基因表示受到调控。

第68页第68页最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。Gengenbachetal（1975）利用玉米T小种毒素筛选取得了抗T小种细胞系，这个基因已知位于胞质中。第69页第69页离体培养细胞会产生各种类型突变体，除抗性突变体外，尚有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状改变等。形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异能够进行高光效育种。第70页第70页培养再生植株中出现不育性频率较高，但大多为核基因突变，能够用来哺育不育系。产量和品质突变必须在田间通过适当分析才干拟定。试验室内细胞水平突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。第71页第71页2、突变体筛选

为了增长突变频率，需要进行诱变处理。将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充足洗涤后再进入下一步工作。使用多大剂量和处理多长时间才干达到较好诱变效果，应依据详细试验拟定。第72页第72页在突变体筛选中常采用两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。

一步筛选法是将培养物接种在含有最低所有致死剂量培养基上，表现出生长培养物再转移到含有克制剂新鲜培养基上。第73页第73页

能够看出，这种办法是一次就把筛选压设定很高，使不抗细胞（野生细胞）完全不也许生长，筛选出能生长细胞即为耐（抗）性细胞系。第74页第74页但在有些情况下这种办法不一定实用，有细胞在超出最低所有致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长细胞系继代到筛选剂浓度提升新鲜培养基上。第75页第75页

在这种筛选体制下，抗性细胞应当比野生细胞长快，通过逐步增长筛选剂水平，最后会筛选出在克制剂超出最低所有致死浓度时也能旺盛生长细胞系。第76页第76页但是，清除克制剂后，抗性培养物稳定性是常出现一个问题，抗性丢失来自诸多原因，包括细胞对克制剂生理适应。可见，多步筛选易取得在某一克制剂水平下，细胞稳定生长细胞系。第77页第77页筛选材料对象能够是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物。利用原生质体进行抗性筛选有一大长处：筛选出克隆极有也许来自单细胞，但是操作困难。第78页第78页利用愈伤块筛选是最简朴办法，但这种筛选存在一定缺点，愈伤块里各个细胞不能均等地接触克制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸取到较多克制剂，这样就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。第79页第79页悬浮细胞筛选也很惯用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定操作复杂性。花粉/小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很容易表现出来，也很易纯合。

第80页第80页3、在作物改良上应用

利用上述办法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。

第81页第81页优良品种

↓

细胞培养

R0

↓

R1群体

↓

改良体细胞克隆

拟定遗传方式

↓

田间试验

遗传稳定性测试

↓

多点田间试验

育成新品系

↓

继续田间试验，种子富集

区域试验

↓

审

定

↓

投入生产

图

利用体细胞克隆变异育种技术路线第82页第82页（二）

单倍体细胞培养及育种利用第83页第83页1、单倍体细胞培养在遗传和育种中应用价值

花药培养（antherculture）是指在取得单倍体一个技术，之后，花粉和小孢子培养逐步取得成功，从而使单倍体细胞培养体系愈加完善。单倍体在遗传和育种研究中有下列长处：第84页第84页（1）后代快速纯合

通过单倍体快速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（DH系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。由于加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。

第85页第85页

母本

×

父本

↓

F1→

花药培养

↓

↓

F2

花粉植株

↓

↓

↓

加倍

↓

↓

品系比较试验

←

选择鉴定

↓

区域试验

图杂交育种与单倍体育种周期比较第86页第86页（2）提升选择效率

假如某一性状受一对基因控制，在AA×aaF2中，纯合AA个体只有1/4。如F1采用花药或花粉培养，产生后代中AA个体占1/2，比常规杂交育种提升一倍。第87页第87页（3）排除杂种优势对后代选择干扰对于杂交育种来讲，因为低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度杂种优势表现，对个体选择会造成一定误差。采取DH群体进行选择育种，因为各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到变异能更大程度上代表真实变异。第88页第88页（4）遗传研究良好材料体系

单倍体是基因互作检测、遗传变异估计、连锁群构建、QTL预计及定位等数量遗传学良好材料。尤其是近代分子生物学发展，DH系成为分子标识作图良好群体，它在一定程度上成为一个永久BC或F2群体。第89页第89页（5）突变体筛选

由于单倍体各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，从而大大提升了抗性或其它突变体筛选效率，利用这一体系取得各种突变体事例已诸多，这里就不一一赘述。第90页第90页2、离体培养条件下小孢子发育

小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花粉正常发育路径受到克制。第91页第91页3、影响花药培养原因

（1）供体植株生长条件供体植株生长条件对培养效果有主要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强条件下，其花药才干有反应。环境条件对于不同植物种有很大不同，因此没有一个固定环境控制模式。第92页第92页（2）供体植株年龄

供体植株对培养效果也有一定影响，普通讲，开花早期植株花蕾易于培养。

第93页第93页（3）花粉发育时期

用于培养花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一次有丝分裂期花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。

第94页第94页（4）花蕾和花药预处理对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提升培养效果。如大麦花药，4℃处理28d，或7℃处理14d，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也有些人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料需不同预处理方式，没有一个固定模式。第95页第95页

（5）培养基终归使用固体或液体培养基应依据培养材料要求定。多数情况下，MS、N6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用较多。花药培养时往往需要一定渗入压，有要求低浓度蔗糖（2%~4%），有要求高浓度蔗糖（8%~12%）。第96页第96页二细胞结构成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖浓度可用到13%~17%。培养基中所添加维生素和激素对培养效果可产生主要影响。对于一些植物种来讲，添加某种植物提取物或椰汁能够改进培养效果。第97页第97页（6）培养条件

多数植物在25℃下培养能诱导愈伤组织，可一些植物，尤其是芸苔属，在高温35℃下处理几天，然后进入25℃培养能收到最好效果。花药培养普通在暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光下培养。另外，接种花药外植体置向、培养密度等有时对培养效果也有影响。第98页第98页4、花粉（小孢子）培养

花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养技术。其长处在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含药壁、花丝、药隔等体细胞组织干扰而形成体细胞植株，但它培养难度大。第99页第99页5、单倍体诱导中存在问题

对于多数植物来讲，能形成有活力胚花药百分率很低，除此之外，尚有诸多问题存在。第100页第100页通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象，或刚开始生长便造成胚败育；在产生单倍体同时产生二倍体或四倍体；培养中我们需要小孢子分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往往难以办到；白化苗难以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性材料中很难分离出单倍体，由于单倍体细胞生长很易被生长旺盛多倍体细胞所掩盖。第101页第101页6、单倍体细胞培养与植物育种

单倍体是高度不育，需要进行加倍处理才干应用。秋水仙素是惯用染色体加倍药剂，能够用1%秋水仙素对正处于对数生长期悬浮细胞进行处理，普通24h左右。也可在固体培养基中加适当浓度秋水仙素。第102页第102页

花粉植株在培养过程中能够自然加倍，但频率很低。将单倍体植株组织或器官用作外植体，重新诱导愈伤组织，让培养细胞在培养过程中自然加倍也是一个办法。第103页第103页A品种

×B品种

↓

F1杂交种

↓小孢子培养或花药培养

单倍体培养

↓染色体加倍

重组纯合系

↓选择

重组了A和B品种长处纯系

↓自交、田间测试

遗传稳定性测试

↓田间测试

新品系→→→→→拟定遗传基础

↓品种亲本

↓-------------------------------杂交

推广利用↓杂种优势利用

图单倍体细胞培养及育种技术第104页第104页（三）幼胚培养与远缘杂交育种

第105页第105页植物胚胎培养（embryoculture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗技术。植物幼胚和胚珠培养是植物远缘杂交育种主要辅助手段。第106页第106页（四）种质长期保留第107页第107页细胞培养和茎尖培养再生植株技术实现为离体试管保留种质提供了条件，这种办法只需要较少空间就能保留大量无性系，并且保留过程中可避免病虫害侵袭，在特定条件下能够长期保留，需要时候只需将材料取出来快速繁殖即可。第108页第108页保留材料能够是各种类型，依植物材料性质和需要定。材料能够是愈伤组织、茎尖、幼胚、花粉形成单倍体愈伤组织等。

第109页第109页保留办法主要有缓慢生长保留法和超低温保留法。对于生长缓慢材料，在常规培养条件下就能保留很长时间，但大多数植物离体培养时需要频繁继代，需要通过减少生长速度来延长继代间隔。第110页第110页缓慢生长法主要是基于改变培养环境和修改培养基来实现对种质资源进行短期和中期保留。缓慢生长法保留技术包括减少培养温度、减少氧气含量、将组培材料脱水干燥等。第111页第111页超低温保留法能够长期保留植物材料，不需要继代，其原理是在超低温情况下，使生物代谢和衰老过程大大减慢甚至完全停止。第112页第112页超低温通常指低于-80℃低温，保留介质或容器有干冰（-79℃）、超低温冰箱（-80—150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽相（-140℃）等，其中液氮最惯用。第113页第113页超低温保留与缓慢生长保留法相比，含有一定技术复杂性，使用时应依据详细材料和相关文献拟定技术方案。第114页第114页（五）脱毒及繁殖主要品种或材料

第115页第115页多数作物，尤其是无性繁殖作物，由于病毒或其它病原菌侵袭，有一个产量和品质下降过程，经常需要对受病毒侵染材料进行脱毒处理。病毒在植物体内分布是不均匀，在受侵染植株中，顶端分生组织普通不带毒，或只携带浓度很低病毒。第116页第116页由于存在这一规律，我们便可利用茎尖培养办法使植物脱去病毒。植物茎尖脱毒在无性繁殖作物提纯复壮中有很主要应用价值，如马铃薯、甘薯、果树、多年生花卉等。第117页第117页组织培养在植物快速繁殖中有较好用途。大多数果树和欣赏植物是高度杂合，它们种子后代无法与原品种相同，在这种情况下，如要保持原种特性，需利用茎尖培养快速繁殖。另外，茎尖培养在保留稀有野生资源、繁殖不育远缘杂种等方面含有优势。第118页第118页植物材料快速繁殖主要是通过诱导茎芽形成实现，能够通过两种路径使茎芽增殖。一个是通过愈伤组织诱导丛生芽形成，然后分株培养，便可取得大量遗传上基本一致无性系。第119页第119页另一个是诱导茎尖或不定芽萌发或形成丛生芽也可达到快速繁殖目的。一些腋芽、植物器官或节段起源芽，普通处于休眠状态，通过离体培养可解除休眠而萌发。植物脱毒与快速繁殖技术很易使一些作物，如甘薯、果树、经济林木等形成产业化，创造明显经济价值。第120页第120页（六）人工种子生产第121页第121页

人工种子（artificialseeds）是指将细胞培养所产生体细胞胚或其类似物，通过有机化合物包埋而形成能在适宜条件发芽类似于天然植物种子颗粒体。它通常由三部分构成：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮。第122页第122页人工种子研究在农业生产上有主要意义，它在固定杂种优势、快速繁殖良种和不育材料、节约用种、工厂化生产种子方面都有潜在价值。对木本植物来说，用人工种子可不必等待漫长有性世代，即能够快速繁殖优良性状转基因植物推广到生产上去。另外，人工种子体积小，便于运送。第123页第123页三、植物原生质体培养和体细胞杂交第124页第124页植物原生质体（protoplast）是一个没有壁细胞，由于没有壁及质膜暴露在外界环境下，使原生质体结构变得很脆弱，在没有一定渗入剂和稳定剂情况下，不久会破裂。由于上述特点，使得原生质体操作难度较大，可一旦再生了壁就恢复了细胞全能性，含有了同正常细胞同样特性。第125页第125页（一）原生质体分离

第126页第126页原生质体分离最基本原则是确保原生质体不受伤害及不损害它再生能力，其先决条件是要有一个适当渗入压。

第127页第127页1、分离办法

分离原生质体办法普通有机械分离和酶法分离两种。第128页第128页

机械法分离是早期采用分离办法，先对材料进行质壁分离处理，然后切割，这一过程中会释放出少许不受损伤原生质体。用这一办法仅能从液泡很大材料中取得原生质体，而不能应用于分生细胞。第129页第129页酶法分离原生质体是当前惯用办法，可分为一步法和二步法。

一步法是将果胶酶（pectinase）和纤维素酶（celluluse）等混合处理材料，直接分离取得原生质体。第130页第130页二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。当前多用一步法。第131页第131页2、影响原生质体分离原因

（1）材料起源

叶肉细胞是惯用材料，由于叶片很容易取得并且能充足供应，另一方面为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。从叶片起源原生质体在遗传上较一致，而培养细胞起源原生质体则不然，由于培养细胞在培养过程中易产生变异。第132页第132页但由愈伤或悬浮系起源原生质体，能够避免植株生长环境不良影响，还能够常年供应，易于控制新生细胞年龄，处理时操作简便，无需消毒。另外，从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生质体。第133页第133页（2）渗入压原生质体分离之前必须拟定一个适合渗入压。在这种渗入压下，原生质体分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤。第134页第134页（3）酶植物细胞壁是一个复杂结构，由纤维素和半纤维素构成，需要一定酶构成才干降解它。广泛使用商品酶制剂能够从诸多公司购买。第135页第135页（4）分离培养基Ca2+对原生质体产量和稳定性有很大影响，它是细胞壁主要成份，同时能稳定膜结构。另外，Mg2+、PO43-对于原生质体活力保持也有主要作用，因此分离原生质体培养基中除酶外，普通含这些离子。第136页第136页（5）培养条件酶处理时温度和pH最主要。PH使用范围为4.8-7.2，可是，高pH（不小于6.0）普通有助于原生质体生存，也许是高pH减少了细胞壁降解时产生有害酶活性和存在于分离培养基中毒性物质活性。为了预防pH改变，常加入MES[2（N-morpholino）-ethanesulfonicacid]。这是一个缓冲剂，普通使用量为3mM。第137页第137页

分离原生质体培养时间与温度成反比，可是，高温下短时间分离原生质体不适于培养，它们易发褐和破裂。惯用温度为23-32℃。有材料温度很低，5-10℃。也有高、低温结合使用。酶处理时普通在暗处培养，但有些材料在光下有利。培养过程中，间断低速震荡有助于酶渗入。第138页第138页（6）组织前处理高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有很好效果。

第139页第139页3、原生质体搜集、纯化和活力测定

原生质体酶解完毕后，将其用200目筛过滤，滤液再用400目过滤，搜集滤液，低速离心，去上清液。用含有酶解液同样渗入剂无酶CPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，重复几次，便完毕原生质体洗涤工作。第140页第140页原生质体纯化可采用蔗糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法，详细操作办法可参考专业书籍。用Evan’sblue或FDA测定原生质体活力，以拟定原生质体分离效果。第141页第141页（二）原生质体培养

第142页第142页原生质体培养前必须调到一定密度，普通103-105/ml密度比较适合原生质体培养。原生质体培养办法各种各样，依作物和材料起源而异。平板培养、液体浅层培养、悬浮培养、液-固双层培养、琼脂糖包埋、看护培养等是原生质体培养惯用办法。第143页第143页但无论哪种培养办法，在培养过程中，都应依据细胞生长情况不断减少渗入压。待肉眼可见细胞团形成后，便可转移到普通细胞培养基上进行细胞繁殖和分化工作。第144页第144页影响原生质体培养原因诸多，物理条件如密度、光照和温度等都会影响培养效果。低于一定密度原生质体不能分裂，普通认为大群体原生质体有助于将培养基中原生质体在培养过程中释放有害物质脱毒。第145页第145页原生质体培养普通在暗处进行，有助于壁形成和细胞再生，有物种始终在暗处直到形成愈伤组织，有一周后移到光下。第146页第146页原生质体培养普通在22-25℃进行，高、低温都有害。但有植物要求27-30℃，在25℃时不能形成愈伤组织。第147页第147页原生质体比细胞需要更复杂培养条件，有时需要在有饲养层细胞情况下原生质体才干再生。培养基无机营养和有机营养构成都对培养效果有明显影响。第148页第148页选择适当渗入压对于取得大量原生质体并保持其活力均很主要，普通用甘露醇或山梨醇调整渗入压。在培养过程中普通需减少渗入压以增进分裂。第149页第149页对于琼脂糖包埋培养，可将其切成小块，转移到低渗液体培养基中漂浮培养，液体培养则可加入低渗一定体积培养基，但普通每一步减少程度不超出25%。现在一个趋势是将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗入压减少，利于细胞分裂。第150页第150页生长素对于培养早期壁形成是需要，最惯用是2，4-D，有时需要生长素与分裂素结合使用。生长素使用量一定要小心拟定，由于它很容易使液泡长大或增长新液泡而使细胞分裂。第151页第151页试验证实，生长素通过调整一些特异mRNA合成而起作用。分裂诱导后，需要转到低生长素条件下才干增进细胞生长。另外，维生素、水解酪蛋白、椰汁等，对原生质体生长有增进作用。在培养过程中也需注意一些氨基酸使用。第152页第152页原生质体形成愈伤团后，便可采用常规愈伤组织培养办法使细胞扩大繁殖或分化形成植株。

第153页第153页（三）细胞融合（体细胞杂交）

物种间生殖隔离阻碍了物种间基因交流，从而给作物育种带来很大不足。原生质体融合技术是实现基因重组一条路径，当前利用细胞融合已从诸多作物种、属间，甚至科间取得杂种体细胞杂种，创造了一些自然界不存在植物类型，有效地拓宽了植物育种资源。第154页第154页1、融合办法

分离原生质体不带电荷，它们互相排斥，因此普通要在诱发条件下才干发生融合。异种原生质体首先发生膜接触，然后两个原生质体形成细胞质桥，最后两种细胞质将两个核包围起来而完毕融合。惯用融合办法简朴简介下列：第155页第155页（1）NaNO3处理诱发融合

由NaNO3诱导可重复、控制离体原生质体融合是由Power等（1970）报道。利用这一融合剂，Carlson等（1972）即使在植物中取得了第一个体细胞杂种，但这种办法存在严重缺点就是融合频率低，并且对于起源于叶肉高度液泡化原生质体有害。这种融合机制普通认为是Na+造成了膜电位改变。第156页第156页（2）高pH—高浓度钙离子处理

烟草叶肉原生质体在高Ca2+（0.05MCaCl2）和高pH（10.5）条件下能不久诱发融合（37℃），但融合频率不很高，高pH也影响原生质体存活率，且易诱发多个原生质体融合。高Ca2+高pH诱发融合机制尚不很清楚，普通认为是改变了膜位及膜物理结构。第157页第157页

（3）PEG（聚乙二醇）处理

PEG诱导不但融合频率高，并且使二核融合频率增长且无特异性。PEG是一个高分子量多聚体（1500—6000），25%—50%PEG可立刻刺激原生质体引起收缩，随后发生汇集。PEG诱发融合后应逐步清除。影响原生质体汇集及随后融合因子诸多，如PEG分子量及浓度、原生质体材料起源、分离原生质体时使用酶制剂、离子种类和浓度、融合温度等。第158页第158页

（4）电融合当两个原生质体处于接触状态时，给一个5—12μamp电流连续1—5s，原生质体首先受刺激，然后马上融合。应用电融合时，原生质体轻微收缩，表明其膜状态有一个短暂改变。第159页第159页电融合包括两个环节：

①电泳：在电极作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。

②融合：由于膜可逆性电激穿，使原生质体发生融合。第160页第160页

原生质体融合很受注重，由于它避免了化学物质潜在毒害。融合率与原生质体起源、体积、念珠链长度、脉冲连续时间及电压等原因相关。在融合时应注意一个问题，即电刺激会造成液泡中一些毒性物质渗漏，影响原生质体活力。假如能用一个办法将液泡分离出来，再诱导融合较好。第161页第161页2、融合方式

原生质体融合有两种融合方式，即对称融合和非对称融合。这两种融合方式都能产生三种类型杂种：综合了双亲所有遗传物质对称杂种；部分遗传物质发生丢失非对称杂种；只含有融合双亲一方核遗传物质胞质杂种。第162页第162页

对称融合即双亲核质组装在一起融合。

非对称融合指在融合前对一方亲本原生质体施加一定处理，纯化其细胞质，再和另一方原生质体融合，从而得到非对称杂种或胞质杂种。第163页第163页

对称融合也可取得这两种杂种，由于一方染色体会发生丢失。在进行非对称融合前，需要对供体和受体进行处理。对供体进行处理目的主要是造成染色体断裂和片段化，从而使供体染色体进入受体后部分或所有丢失，达到转移部分遗传物质或只转移胞质基因组目的。第164页第164页

对供体进行处理办法有各种：射线（X、γ和紫外线）辐射原生质体；限制性内切酶处理原生质体；纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体，其中射线作用最好。

第165页第165页为了减少融合后再生后代筛选工作，研究者利用一些代谢克制剂处理受体原生质体以克制其分裂。惯用克制剂有碘乙酸（IA）、碘乙酰氨（IOA）和罗丹明（R-6-G）。第166页第166页R-6-G克制线粒体氧化磷酸化，IA、IOA能够克制线粒体氧化磷酸化或糖酵解过程，从而不能为细胞生长和发育提供能量。受IA、R-6-G和IOA处理细胞和非代谢克制剂处理细胞（供体，核钝化，但线粒体正常）发生融合后，代谢上就会得到互补，从而能正常地生长。第167页第167页3、杂种细胞筛选

原生质体融合后，必须有一个可行办法分离出融合杂种，假如培养条件只允许杂种细胞生长，而不允许亲本细胞生长当然最好。杂种细胞筛选很主要，由于原生质体密度很高，亲本原生质体生长不久掩盖杂种细胞生长，除非杂种细胞了含有生长优势。惯用杂种细胞筛选体系有下列几种：第168页第168页（1）形态互补利用两种原生质体形态色泽上差别，在融合处理后，分别接种在带有小格培养皿中，每个小格中约有2—3个原生质体。在显微镜下能够找出异源融合体并标定位置。第169页第169页（2）遗传互补利用两个白化突变互补可以进行筛选。单个隐性突变性状（如白化）可以与某一形态性状结合起来用于筛选。如Daucuscarota是一白化突变，D.capillifolius是正常体但再生率很低，将上述两种原生质体融合后，绿色愈伤组织多为杂种细胞形成。然后再结合形态及染色体数目检查就可进一步证实。第170页第170页

（3）代谢互补利用两种营养缺点型或两种抗性突变体原生质体进行融合，在同时缺点两种物质或同时含有两种有害物质培养基上筛选杂种细胞，能生长细胞团能够初步认为由杂种细胞形成。

第171页第171页

（4）生长互补Carlson等（1972）发觉，双亲原生质体生长需要外源生长激素，而由双亲原生质体融合后形成对生长激素自主杂种细胞，能在无外源生长激素培养基上生长。用这一特点选出了粉蓝烟草与郎氏烟草体细胞杂种。第172页第172页4、杂种鉴定

通过杂种细胞筛选取得再生植株不一定是杂种植株，应通过进一步验证才干拟定。有各种鉴定杂种办法。依据形态性状判断是最简朴办法，杂种植株叶形通常介于双亲之间，叶面积居中，花器官（花冠长度、颜色、形态等）带有双亲性状。第173页第173页

染色体计数是细胞学鉴定体细胞杂种基本办法，但杂种染色体数目不一定正好是双亲染色体数目之和，常出现混倍体。染色体数目的改变也许来自多细胞融合、培养过程中细胞学变异和核与质基因融合后不亲和。第174页第174页

惯用生化鉴定办法是同工酶，融合后形成杂种应当表现出双亲同工酶带型。分子标识鉴定能够较准确地反应融合是否成功，RAPD、RFLP、AFLP是惯用鉴定杂种分子标识。第175页第175页5、细胞融合与作物育种

利用细胞融合能够克服远缘杂交不亲和性，创造种间、属间杂种，为作物育种提供新材料。第176页第176页但是，细胞融合获得杂种一般在生产上难以直接利用，但这一技术可认为作物育种创造自然界不存在新资源，对作物育种种质资源拓展有十分重要意义。第177页第177页第二节转基因技术与作物育种

第178页第178页作物转基因育种就是依据育种目的，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，通过筛选取得稳定表示遗传工程体，并通过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。第179页第179页作物转基因育种涉及目的基因分离与改造、载体构建及其与目的基因连接等DNA重组技术；通过农杆菌介导、基因枪轰击等办法使重组体进入受体细胞或组织以及转化体筛选、鉴定等遗传转化技术和相配套组织培养技术；取得携带目的基因转基因植株（遗传工程体）；遗传工程体在有控条件下安全评价以及大田研究直至育成品种。第180页第180页与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是含有常规育种所不具备优势。主要表达在：第181页第181页

⑴转基因育种技术体系建立使可利用基因资源大大拓宽。实践表明，从动物、植物、微生物中分离克隆基因通过转基因办法可使其在三者之间互相转移利用。第182页第182页⑵转基因育种技术为哺