丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响,细胞生物学论文

丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响,细胞生物学论文间充质干细胞〔mesenchymalstemcells，MSCs〕具有高度增殖和多谱系分化能力，与各种组织的功能维持与修复再生有着密切的联络。但MSC可在体内外环境的影响下，出现增殖能力下降，甚至发生凋亡等现象。在这些影响因素中，活性羰基类物质〔reactivecarbonylspecies，RCS〕对MSCs的生物学行为的影响尚未报道。RCS主要由多不饱和脂肪酸过氧化，在氧化应激条件下，其生成量显著增加.对组织功能和正常更新产生严重影响。丙二醛〔malondialdehyde，MDA〕是一种代表性的RCS。本工作进行以小鼠骨髓MSCs的体外培养，研究MDA对这种干细胞凋亡的影响，为全面认识RCS的病理生理作用提供实验证据。1、材料与方式方法1.1材料雌、雄性Balb/c小鼠各半，6~8周龄，体重201.5g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，1，1，3，3-四甲氧基丙烷〔美国Fluka公司〕；低糖DMEM培养基〔美国Gbico公司〕；胎牛血清〔美国Hyclone公司〕；荧光定量PCR仪〔7500fastrealtimesystem,美国ABI公司〕；TRIzol试剂〔美国Inritrogen公司〕；Taqman逆转录酶试剂盒和SYBRGreenMasterMix(美国AppliedBiosystems公司；Anti-Bcl-2；Anti-Bax；Anti-Caspase-3〔美国SantaCruz生物公司〕；Anti-actin〔美国Sigma公司〕；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒〔美国Roche公司〕。1.2MDA的配制将0.423mL〔2.5mmol/L〕的TMP与1.0mol/L的HCl2.0mL混合后，在40℃的水浴中振荡水解2.5min，TMP完全水解后用6.0mol/L的NaOH调节pH值至7.2，最后用PBS定溶到50mL，并测定储备液在267nm〔ε=31500〕的紫外吸收值来确定能否符合要求浓度。利用酸水解1，1，3，3-四甲氧基丙烷〔TMP〕法配置50mol/L的MDA储备液。1.3MSC的体外培养无菌条件下取小鼠双侧股骨胫骨，以DMEM培养液冲洗髓腔，获得骨髓细胞，制备骨髓单细胞悬液。将骨髓有核细胞种于培养瓶中，接种密度为每mm2培养瓶底5106个，培养体系为含10%胎牛血清的DMEM，于37℃、10%CO2、饱和湿度下培养。每3d更换培养液，继续培养,细胞至铺满瓶底时，用胰蛋白酶消化法收集贴壁细胞,于同样培养体系和条件下传代培养,以扩增和纯化骨髓MSCs.取传代培养P3代的MSCs，实验组另加MDA〔终浓度为0、0.01、0.1、1.0mmol/L〕，培养24h后，所有组更换培养基，继续培养9d。1.4流式细胞技术细胞以2l03/cm2细胞密度接种于细胞培养瓶中，每瓶8mL，培养至7d，用胰蛋白酶将细胞消化，取单细胞悬液2106个细胞于PBS〔pH=7.2〕缓冲液中，500g离心5min，弃上清，反复两次，将单细胞悬液放置于2～3mL冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30min，离心洗涤两次，参加PI，上机检测。1.5TUNEL法实验详细步骤参照Roche公司细胞凋亡试剂盒讲明书,结果分别用荧光显微镜观察。凋亡细胞即TUNEL〔TdT-mediateddUTPnickendlabel－ing〕阳性细胞，在荧光显微镜下呈黄绿色荧光，非凋亡细胞无荧光显示。油镜下，每一组随机观察500个细胞，分别计数视野内TUNEL阳性细胞和TUNEL阴性细胞。以凋亡细胞数与细胞总数的比率作为该标本的凋亡指数〔Apoptosisindex，AI〕，计算4组凋亡指数。1.6荧光定量PCR各组细胞经7d诱导培养后，RNA的分离提取，按Trizol试剂讲明书进行。按TaqMan试剂盒要求，2gRNA被逆转录成cDNA。用SYBRGreenMaterMix试剂检测待测的基因的mRNA水平，共重复检测3次。PCR反响条件：95℃45s,94℃45s，50℃45s,72℃90s,35个循环,72℃延伸10min。mRNA水平用-Actin作内对照标化，基因的表示出用△△Ct法定量分析。PCR引物序列见表1。1.7Western印迹分析用冰冷的PBS洗涤细胞3次，加细胞裂解液，在冰上将细胞迅速刮下，冰浴条件下超声破碎细胞，离心后吸出上清液体，用Bradford方式方法进行蛋白质浓度测定，取提取的蛋白质样品〔25g〕参加等体积上样缓冲液，100℃煮5min，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至PVDF膜上，封闭液室温封闭1h，1∶1000一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，1∶2000二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次，ECL发光显影。条带进行图像分析，测定灰度值，用-Actin作内对照标化来表示各组MSC的Bcl-2、Bax、Caspase-3相对表示出量。1.8统计学处理所有数据用平均值标准差〔xs〕表示。多组间比拟，采用方差分析；显著性水平为P0.05。SigmaPlot计算机软件作图。2、结果2.1MDA增加TUNEL阳性细胞百分率如此图1所示，与对照组相比，0.1、1.0mmol/LMDA处理组TUNEL阳性细胞百分率明显增加。0.01mmol/L组TUNEL阳性细胞百分率，与对照组差异无显著性。2.2MDA增加MSC亚G1峰凋亡细胞百分比流式细胞术结果显示，与对照组相比，MDA处理使得MSC亚G1峰凋亡细胞百分比增加。0.01、1.0mmol/LMDA处理作用更明显，呈一定的剂量相关性〔见图2〕。2.3MDA降低Bcl-2mRNA及蛋白的表示出与对照组相比，MDA处理组的Bcl-2mRNA及蛋白表示出水平随着浓度增加，明显降低，呈浓度依靠性，这表示清楚MDA能降低Bcl-2mRNA及蛋白的表示出，结果见图3。2.4MDA增加BaxmRNA及蛋白的表示出与对照组相比，MDA处理组的BaxmRNA及蛋白表示出水平随着浓度增加明显增加，呈浓度依靠性，这表示清楚MDA能增加BaxmRNA及蛋白的表示出，结果见图4。2.5MDA对Bax/Bcl-2比值的影响如此图5所示，与对照组相比，MDA处理能够增加Bax/Bcl-2mRNA表示出水平比值；中高浓度1.0、0.1mmol/LMDA增加Bax/Bcl-2比值的作用愈加明显，呈浓度依靠性。2.6MDA对Caspase-3mRNA及蛋白相对表示出水平的影响。如此图6所示，与对照组相比，MDA处理组的Caspase-3mRNA及蛋白表示出水平随着浓度增加明显增加，呈浓度依靠性，这表示清楚MDA能增加Caspase-3mRNA及蛋白的表示出。3、讨论本实验的结果表示清楚，MDA能够诱导小鼠骨髓MSC细胞凋亡。Rittie研究发现，丙二醛结合蛋白的影响成纤维细胞的功能。Long报道MDA抑制离体大鼠肝线粒体呼吸功能以及酶的活性，线粒体功能障碍与多种老年性退行性疾病密切相关。用MDA处理大鼠海马CA1区神经元后，细胞内线粒体发生变形、嵴消失，进而导致空间学习、记忆能力降低。MDA与多种老年性退行性疾病密切相关。活性羰基类物质丙酮醛〔methylglyoxal，MGO〕损伤海马神经元细胞导致其认知功能的降低。凋亡调控细胞增殖与更新间的平衡，这种平衡对维持生物体的发育及正常功能构造起着特别重要的作用。因而，MSC的凋亡与多种器官组织退行性改变密切相关。凋亡的亚细胞和分子方面的调控已被广泛研究，凋亡级联反响的主要调节因子是Bcl-2家族成员，包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白。脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛〔4-hydroxy-nonenal，4-HNE〕通过降低Bcl-2的表示出，增加Bax的表示出进而诱导PC12细胞的凋亡。我们初次报道MDA诱导的MSC细胞凋亡机制中牵涉Bcl-2家族成员，Bcl-2及Bax的调节。天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶〔Caspases〕家族的激活在哺乳动物细胞凋亡经过中起关键作用，是凋亡的执行者。Kutuk等报道：4-HNE通过线粒体释放细胞色素C，激活Caspase-3诱导3T3成纤维细胞的凋亡，与多种老年性退行性疾病密切相关。Almeida等报道4-HNE诱导小鼠成骨细胞的凋亡，是老年性骨质疏松症的机制中重要环节。MDA能否能够直接激活MSC细胞C