精选扩增和电泳检测讲义

（优选）扩增和电泳检测当前1页，总共31页。电泳观察PCR反应

实验步骤当前2页，总共31页。DNA在体内复制的条件是什么？模板：酶：原料、能量：解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每条链dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物：温和的反应条件当前3页，总共31页。DNA分子的结构当前4页，总共31页。合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸当前5页，总共31页。合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP当前6页，总共31页。

聚合反应机理：当前7页，总共31页。DNA聚合酶当前8页，总共31页。不同细胞的细胞周期

不同生物细胞

需要的时间细菌一般是20~30分钟蚕豆根尖细胞17.3小时小鼠十二指肠细胞15.3小时人的肝细胞22小时人的宫颈癌细胞22.5小时PCR技术可在几小时内，将特定核酸序列扩增百万倍!当前9页，总共31页。PCR的概念

PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。当前10页，总共31页。

PCR的反应体系DNA模板原料：

dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物：（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶

当前11页，总共31页。PCR技术原理变性退火延伸当前12页，总共31页。PCR三步曲

预变性保温变性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃当前13页，总共31页。PCR仪当前14页，总共31页。用于PCR的预混液（500L体系）：

ddH2O310L10×butter50LMgCl240LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25L

TaqDNA聚合酶5L

标记一个微量离心管，用取样器取20L的预混液加入到该管中。当前15页，总共31页。反应试剂

用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ（浓度10μM）1μL引物Ⅱ（浓度10μM）1μL模板DNA5μLddH2O3μL总体积20μL当前16页，总共31页。微量可调移液器（一档吸、二档排）当前17页，总共31页。PCR反应参数：

变性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s

预变性94℃300s

保温72℃600s循环次数35当前18页，总共31页。1、基本概念以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳当前19页，总共31页。琼脂糖凝胶电泳基本原理当前20页，总共31页。当前21页，总共31页。制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。琼脂糖凝胶电泳的过程当前22页，总共31页。将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。制胶当前23页，总共31页。将梳子从制胶槽中拔出

当前24页，总共31页。取出凝胶板放入电泳槽中

向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶

当前25页，总共31页。

琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1、增加电导率；2、维持电泳过程中的合适的pH。当前26页，总共31页。吸取PCR反应产物10µL。注意吸头要插入到管底，才能取到PCR产物。

将PCR产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次）

混样当前27页，总共31页。常用的上样缓冲液配方及各成分的作用蔗糖使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。溴酚蓝增加样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内。核酸荧光染料可嵌合入DNA分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。（需要与加样缓冲液混合）当前28页，总共31页。加样当前29页，