DB36T 1744-2023 柑橘裂皮病和柑橘碎叶病RT-PCR检测技术规程

ICS 65.020.01CCSB16

DB36发布发布江西省市场监督管理局2023080120230210TechnicalspecificationfordetectingCitrusexocortisandCitrustatterleafbyRT-PCR江 西 省 地 方 标 准DB36/T1744—2023RT-PCR规程DB36/T1744DB36/T1744—2023DB36/T1744DB36/T1744—2023II附录B（料）橘叶病本息 8附录C（范）要器设和剂 9附录D（范）测剂和液制 11目 次前言 II1围 12范引文件 13语定义 14品集 25品RNA备 26RNA取量价 37RT-PCR检测 38泳成分析 59果定 510测样的理 6附录A（料）橘皮病本息 7IIII前 言本文件按照GB/T1.1-2020给出的规则编写。113.1柑橘皮病 Citrusexocortisdisease由柑橘裂皮病类病毒引起的柑橘病害，参见附录A。3.2柑橘碎叶病Citrustatterleafdisease由柑橘碎叶病毒引起的柑橘病害，参见附录B。3.3柑橘裂皮病的病原Citrusexocortisviroid(CEVd)一种类病毒，没有蛋白质衣壳，是游离的低分子量核糖核酸（RNA），病原可通过嫁接、修剪工具传播。3.4柑橘碎叶病的病原Citrustatterleafvirus（CTLV）发状病毒属，病毒粒子为曲杆状，基因组是单链正义RNA分子，病原可通过嫁接、机械和菟丝子传播。3.5柑橘裂皮病和柑橘碎叶病RT-PCR检测技术规程范围RNARNA本文件适用于柑橘类植物材料中疑似感染柑橘裂皮病或柑橘碎叶病的病原检测和病害鉴定。GB/T37874-2019核酸提取纯化方法评价通则下列术语和定义适用于本文件。反转-合链反应 RT-PCR经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。3.6扩增引物primer人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标核酸序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3.7扩增模板templateDNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。枝剪、剪刀等工具类，使用前后应（121±2）℃高压灭菌20min；样品袋、刀片、手套等耗材类应一次性使用，避免样品间相互污染。从树冠东、南、西、北四个方向各采集中部枝条1支，每支枝条至少带32℃～8-70RNA3-40.5cm～1.0cm0.1cm100mgTriZolRNA，100mg1.5L100L的Trol515n。4℃下，12000g5min5001.5mL离心200μL氯仿-10s5。412000g102001.5mL离心42001小时。233冰上操作按下表2向上述PCR反应管中加入DEPC处理水、RT缓冲液、RRI、M-MLV，即体系Ⅰ和体系Ⅱ合并20µL，混匀并低速离心，转入PCR扩增仪中反应。PCR反应程序：30℃10min，42℃50min，75℃15min。合成产物备用。1DEPCdNTPPCR转入PCR扩增仪中反应。PCR反应程序：65℃预变性5min。取出后立即冰水浴5min。表1 cDNA第链成系Ⅰ4℃下，12000g10475%1412000g5min75%1mL2412000g55DEPC（20μL-60μL），-20℃保存，作为后续RT-PCRRNA依据GB/T37874-2019RNA100mgRNA产量≥500ngRNA的OD260/OD280为2.0，当RNAOD260/OD280在1.7～2.0RNART-PCR所制备的RNA样本在4℃条件下保存应不超过7天，在-20℃冻存不超过30天，避免反复冻融。RT-PCRcDNA检测试剂终浓度每管加入量/µL随机引物6N[10µM]1µM1dNTP[2.5mM]0.25mM1RNA模板－3DEPC处理水－5总体积－1044冰上操作按表2加入PCR缓冲液、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、cDNA第一链合成产物于新的PCRPCRPCR94℃2min；32(94℃20s，58℃20s，72℃45s)；72℃10min检测时同时设阴性对照、柑橘裂皮病阳性对照和水空白对照。7.2.2 PCR（1）柑橘碎叶病扩增引物序列：表3 柑橘病PCR扩体系表2 cDNA第链成系Ⅱ检测试剂终浓度每管加入量/µLRT缓冲液[×5]2×4RNA酶抑制剂（RRI）[40U/µL]2U/µL0.5反转录酶（M-MLV）[200U/µL]20U/µL1DEPC处理水－4.5总体积－10PCRPCR柑橘裂皮病正向引物：5’-CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’；柑橘裂皮病反向引物：5’-GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3’；柑橘裂皮病PCR3。检测试剂终浓度每管加入量/µLcDNA第一链合成产物－1PCR缓冲液[×10]12.5dNTP[2.5mM]0.2mM2.0柑橘裂皮病正向引物[10µM]0.2µM0.5柑橘裂皮病反向引物[10µM]0.2µM0.5Taq酶[5U/µL]0.1U/µL0.5DEPC处理水－18总体积－25.0柑橘碎叶病正向引物：5’-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’；柑橘碎叶病反向引物：5’-AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3’；（2）柑橘碎叶病PCR体系配置，见表4表4 柑橘病PCR扩体系检测试剂终浓度每管加入量/µLcDNA第一链合成产物－1PCR缓冲液[×10]12.5dNTP[2.5mM]0.2mM2.0柑橘碎叶病正向引物[10µM]0.2µM0.5柑橘碎叶病反向引物[10µM]0.2µM0.5Taq酶[5U/µL]0.1U/µL0.5DEPC处理水－18总体积25.0加入PCRdNTP、TaqcDNAPCRPCR394℃s，60℃20s，72℃s)；72℃10min4检测时同时设阴性对照、柑橘碎叶病阳性对照和水空白对照。分别将PCR扩增产物与上样染料混匀后，加入到1.2%琼脂糖凝胶点样孔中，同时设置DNAMarker标准分子量作为标记片段大小的标准，在1.2%琼脂糖凝胶中150V电压电泳30min。将电泳后的琼脂糖凝胶经核酸染料染色后置于凝胶成像系统观察，分析结果并成像保存。样品RT-PCR371bp样品RT-PCR889bp566371bp371bp889bp889bp-20℃RNA80℃77A.6 附 录 A（资料性）柑橘裂皮病基本信息CitrusexocortisCitrusexocortisviroidCEVd110℃10min2-388CTLVCTLV(Ruskcitrange)(TroyercitrangeB.6 附 录 B（资料性）柑橘碎叶病基本信息：CitrustatterleafCitrustatterleafvirus（CTLV）（Capillovirus），CTLV（600～700）nm×（13～15）nm4d～8d，65℃～70℃处理10min99B：——焦碳酸二乙酯（DEPC）。——RNA抽提试剂（TriZol）。——氯仿-异戊醇（24：1）。——异丙醇，分析纯试剂。——无水乙醇，分析纯试剂。C.2 ——凝胶成像系统——超纯水仪。——高压灭菌锅。——微量核酸测定仪。（0.5、1.5mL、2.0——PCR反应管。——吸头（1000μL、200μL、10μL）附 录 C（规范性）主要仪器设备和试剂C.1 除非另有说明，实验器具均用DEPC水清洁处理或购买无DNA/RNA酶的实验器具：——PCR扩增仪。——髙速台式离心机。——生物安全柜或超净工作台。——冰箱(冷藏室4℃和冷冻室-20℃)。——涡旋混匀仪。——制冰机。——微量可调移液器（1000μL、200μL、10μL）。——核酸电泳仪、电泳槽。1010——100bp梯度DNA（Marker）：100bpDNAladder。——电泳缓冲液（50×TAE）。——琼脂糖。——核酸染色剂。——样品缓冲液：6×LoadingBuffer。——PCR缓冲液[10×PCRbuffer]。——DNA聚合酶[5U/µL]。——四甲基乙二胺二钠盐（EDTA-Na2），分析纯试剂。——三羟甲基氨基甲烷（Tris），优级纯试剂。——浓盐酸（HCl），分析纯试剂。——冰醋酸，分析纯试剂。——蔗糖，分析纯试剂。——溴酚蓝，分析纯试剂。——氢氧化钠，分析纯试剂。——二甲苯青。。——RT缓冲液[5×PCRbuffer]。——dNTP[2.5mM]：脱氧核糖三磷酸腺苷混合物。——反转录酶(M-MLV)[200U/μL]。——酶抑制剂（RRI）[40U/μL]。1111D.7 75 （DNA/RNA>300bp）20gNa2EDTA·2H2O、0.050.05gFF100mL36mL800μL5NaOH30mL的ddH2OddH2O100mL1.5mL204℃存放。D.6 6×oadngffer：D.5 （5×AE：称取242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O和57.1mL冰醋酸于1L烧杯中，加800mL去离子水搅拌溶解，加去离子水定容至1L，室温保存，使用时稀释至1倍。配制1.2%质量体积比的琼脂糖粉与1×TAE电泳缓冲液溶液，加热融化成均一琼脂糖溶液，冷却至室温导入插好梳子的制胶槽中，凝固后点样电泳。D.4 1.2称取94gNa2EDTA500mL400mLddH2O10.3ddH2O定容至200mL，121℃20min高压灭菌后，室温保存。附 录 D（规范性）检测试剂和溶液配制除非特殊说明，本标准所有试剂配制均用DEPC处理水，4℃保存备用。含有Tris的溶液不可用DEPC水配制。DEPC吸取1mLDEPC溶液用ddH2O水定容到1L，常温磁力搅拌过夜，121℃20min高压灭菌后使用。1MTrs-HlpH.0：称取24.228gTris250mL160mL9.2ddH2O200mL，121℃min0.5MEDTA（H80：12