实验二细菌涂片的制备和染色镜检1

细菌染色的目的意义：细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。当前1页，总共33页。染色剂分类：碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构。酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于染细胞质。复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次体。当前2页，总共33页。

涂片染色程序：

涂片自然干燥固定染色干燥镜检

当前3页，总共33页。细菌涂片示例：

水当前4页，总共33页。实验内容：1、

细菌抹片的制备：玻片准备：透明、洁净、无油渍。抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。2、

细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。3、

细菌常用染色方法：革兰氏染色法

细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色

细菌抹片的制备当前5页，总共33页。革兰氏染色法：

1.制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。

2.初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。

3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。

4.脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。

5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。

6.镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。当前6页，总共33页。革兰染色步骤涂片草酸铵结晶紫

碘液95%酒精稀释的石炭酸复红自然干燥媒染2-3min脱色20~30s固定初染1-2min复染10~30s干燥

镜检接种环蒸馏水滴水当前7页，总共33页。革兰染色时注意事项：

1、要用幼龄培养物作革兰染色；

2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性当前8页，总共33页。革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。

革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭酸复红复染后细胞呈红色。

当前9页，总共33页。革兰氏染色法原理：

革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。

当前10页，总共33页。革兰氏染色法过程示意图革兰氏染色法动画当前11页，总共33页。当前12页，总共33页。当前13页，总共33页。涂片干燥固定染色1~2min水洗、吸干镜检细菌的单染色当前14页，总共33页。显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。染色法——细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。细菌形态与结构检查法当前15页，总共33页。普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。普通光学显微镜(lightmicroscope)显微镜放大法当前16页，总共33页。电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。电子显微镜(electronmicroscope)肺炎链球菌荚膜荚膜显微镜放大法当前17页，总共33页。透射电镜扫描电镜当前18页，总共33页。细菌的大小与形态观察细菌常用光学显微镜，其大小用测微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm)为单位。不同种类的细菌大小不一，同一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而有差异。细菌按其外形，主要有球菌杆菌螺形菌当前19页，总共33页。球菌(coccus)脑膜炎奈瑟菌双球菌(diplococcus)肺炎链球菌当前20页，总共33页。链球菌(streptococcus)球菌(coccus)当前21页，总共33页。球菌(coccus)葡萄球菌(streptococcus)当前22页，总共33页。球菌(coccus)四联球菌(tetrad)当前23页，总共33页。球菌(coccus)八叠球菌(sarcina)当前24页，总共33页。杆菌(bacillus)不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。炭疽芽胞杆菌3-10μm大中大肠埃希菌2-3μm小布鲁菌0.6-1.5μm当前25页，总共33页。杆菌的形态多样杆菌(bacillus)两端齐平炭疽芽胞杆菌两端尖细白喉棒状杆菌当前26页，总共33页。杆菌(bacillus)杆菌的形态多样分枝杆菌双歧杆菌当前27页，总共33页。螺形菌(spiralbacterium)弧菌螺菌螺杆菌当前28页，总共33页。细菌抗酸性染色当前29页，总共33页。特殊染色法

是对细菌特殊结构进行染色的方法。包括芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色等。当前30页，总共33页。芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养体的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比营养体细胞困难。当前31页，总共33页。方法：采用碱性染料微加热着染或延长染色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色后，再脱去营养体细胞的