分子生物学DNA变性与修复

分子生物学DNA变性与修复第1页/共51页Wheredoesthemutationcomefrom?DNAreplicationChemicaldamagetothegenematerialInsertionscausedbyDNAelementsLifeandbiodiversitydependonahappybalancebetweenmutationanditsrepair.第2页/共51页

突变体(mutant)：携带突变的生物个体或群体或株系

突变基因(mutantgene):存在突变位点的基因野生型基因（wildtypegene）：表示方法表现型Arg+Arg-

基因型arg+arg-

野生型正性状第3页/共51页

●Chromosomemutation

chromosomenumber

chromosomestructure

●核苷酸突变（pointmutation）

突变(mutation)：可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变第4页/共51页Pointmutation－－－碱基替代、碱基插入、碱基缺失转换(transition)PyPy

Pu

Pu

颠换(transvertion)

Py

Pu

PointmutationsT-CandA-GT-G/AandA–C/T第5页/共51页Replicationerrorsandtheirrepair第6页/共51页DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)经第二次校正ξ=10-11错配修复系统(MRSMismatchRepairSystem)1）.source：校正活性所漏校的碱基

thefidelityofthereplicationcanimprove102～103times1.Mismatchrepairremoveserrorsthatescapeproofreading第7页/共51页DNApolymeraseHelicaseSSB外切核酸酶(Ⅰ和Ⅶ)ligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,SdamgeneDNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶)扫描新生链中错配碱基识别新生链中非m6A的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段

2).Components第8页/共51页Mismatchrepairpathwayfortherepairofreplicationerrors第9页/共51页★thetransienthemimethylationintheDNAreplicationDammethylasemethylatesAresiduesonbothstrandsofthesequenceGATC(palindromicseq.)平均每2kb左右有一GATCseq.第10页/共51页a、DNA/MutS

complexrecruitsMutLDNAhelicaseII,SSB,exonucleaseI去除包括错配碱基的片段DNApolymeraseIII和

DNAligasefillthegap昂贵的代价用于保证DNA的准确性3）.

TheprocessofrepairMutLactivatesMutH,whichcausesanickonthestrandnearthesiteofthemismatch

第11页/共51页外切核酸酶Ⅰ切割切点的5’端（错配碱基在切点的5’端）

----------------Ⅶ----------------3’端（--------------------------3’端）第12页/共51页第13页/共51页HowtorepairDNAdamage?Wheredoesthedamagecomefrom?mutagen第14页/共51页1.Alkylation(烷化剂)亚硝酸（nitrousacidHNO2）羟氨（hydroxylamineHA）甲磺酸乙酯（ethylmethanesulfonateEMS）

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidionNNG）第15页/共51页NH2OH(Hydroxylamine

HA羟胺)C(i)A(a)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOHNHHOHNHHONH能使胞嘧啶（C）先变成羟氨基胞嘧啶，再经互变异构反应变成能与腺嘌呤配对的羟氨基胞嘧啶第16页/共51页2.RadiationUltravioletlight,γradiation,x-ray

---嘧啶二聚体(TTdimer)∧U.V.…CTTA…第17页/共51页

脱氨氧化

U.V.CUA(a)U.V.U.V.H2OH++OH-C(a)

C(i)A(a)

脱嘌呤造成的突变：碱基替代、缺失、重复、移框第18页/共51页3、BaseanalogAbaseanalogisachemicalthatcansubstituteforanormalnucleobaseinnucleicacids.第19页/共51页5-溴尿嘧啶5-BromineUracil第20页/共51页5-BrU:G:A

烯醇式enolBrOHHOBr

酮式KetoHOAGCTTCCTATCGAAGGATAGCTBCCTATCGAAGGAT酮式5-BrU的渗入AGCTBCCTATCGAAGGATAGCTCCCTATCGAGGGAT第二轮复制A·TG·C

转变AGCTBCCTATCGAGGGATAGCTTCCTATCGAAGGAT第一轮复制酮式到稀醇式的转变烯醇式渗入为G·CA·T

转变第21页/共51页吖啶橙(AcridineOrangeAO)扁平染料分子溴化乙锭(EthidiumBromideEB)-ATTTTTCG--TAAAAAGC--ATTTCG--TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG--TA分子插入AOEB-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-XAAAAGC-结果产生－－－移框突变第22页/共51页ThesystemsrepairingdamagetoDNAExcisionrepairsystemsRecombinantionalrepair第23页/共51页1.DirectrepairofDNA是通过一种可连续扫描DNA，识别出损伤部位的蛋白质，将损伤部位直接修复的方法。该修复方法不用切断DNA或切除碱基。例如：在所有原核和真核生物中都存在一种光激活酶。在可见光下，这种酶可以结合在胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲双螺旋部位，催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的A-T碱基对重新形成。第24页/共51页photoreactivation第25页/共51页2.MethylgroupremovalThemethyltransferaseisnotcatalytic;havingonceacceptedamethylgroup,itcannotbeusedagain.第26页/共51页甲基转移酶Cys-SHCys-S-CH3第27页/共51页3.核苷酸切除修复UvrABC核酸切割酶原核生物

12-13个核苷酸真核生物

27-29个核苷酸

UvrD(DNAhelicase)DNApolΙLigase(NucleotideExcisionRepairNER)第28页/共51页第29页/共51页★Rec-A.gene

以某种方式参与DNA损伤修复♦Rec修复系统比切除修复系统更有效

目前知道

♫Uvr系统负责切除二聚体♫Rec系统负责消除没有被切除的二聚体可能造成的后果4.Recombinative—Repair复制后修复、E.coli的挽回系统第30页/共51页TTTTAAAATTTTTTTTAAAATTTT变性

E.coli(Rec-A,uvr-a-)D.S.DNAS.S.DNAU.V.复制提取变性复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口★二聚体后起始★修复时期的证明第31页/共51页●与Rec-A蛋白引起的重组(strandtransfer)有关●TTdimer未被修复，仅表现在后代群体中TTdimer

浓度的稀释●链的非准确转移，导致突变机率的增加修复相关机制:第32页/共51页

重组修复

(链转移修复)

复制后修复容易出错RecA,DNApolymeraeligase二聚体后起始RecA

聚合酶、连接酶重组修复后的损伤位点可由其它机制进一步修复第33页/共51页RecA蛋白首先与单链DNA结合（需消耗ATP）。于是RecA蛋白即被活化而可将双螺旋解旋和分离，同时企图将它结合的单链与被解旋区域退火，如此继续下去，直到找到互补顺序。只要一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继续驱使配对反应趋于完成。当新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。第34页/共51页Repairdouble-strandbreakNonhomologousendjoining:isabackupsysteminyeast,butinhighercellsitistheprinciplepathwaybywhichbreaksarerepaired第35页/共51页第36页/共51页第37页/共51页5.SOS

respones(SOS修复)TheSOSresponseisaglobalresponsetoDNAdamageinwhichthecellcycleisarrestedandDNArepairandmutagenesisareinduced.TheSOSusestheRecAprotein(Rad51ineukaryotes).TheRecAprotein,stimulatedbysingle-strandedDNA,isinvolvedintheinactivationoftheLexArepressortherebyinducingtheresponse.Itisanerror-pronerepairsystem.第38页/共51页FunctionofRecAproteina、DNA重组活性b、与S.S.DNA结合活性c、少数蛋白的proteinase活性第39页/共51页mechanismofSOSresponseSOS修复－－无模板指导的DNA复制

大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生SOS系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行错误碱基第40页/共51页SOS修复只是SOS反应的一部分RecA在SOS反应反应中起核心作用RecA与LexA组成调控环路DNA损伤

SOSRecA受LexA的部分抑制第41页/共51页当DNA复制受阻/DNAdamaged细胞内原少量表达的RecA-p与S.S,DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达SOSopen当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）RecA-p不表现proteinase活性第42页/共51页当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种错误倾向性极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff第43页/共51页第三节限制和修饰第