分子生物学实验五

分子生物学实验五第1页/共22页电泳概念电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－带负电粒子带正电粒子正极负极第2页/共22页

颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗粒表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。第3页/共22页影响琼脂糖电泳迁移的因素主要因素DNA的大小DNA的构象琼脂糖浓度缓冲液外界因素电场强度溶液的pH值溶液的离子强度温度的影响支持物的影响第4页/共22页

凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]

线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35~60.61~20

0.7

0.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~32.00.1~2分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度第5页/共22页

对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。第6页/共22页缓冲液TAE：乙酸盐缓冲液TBE：硼酸盐缓冲液TPE：磷酸盐缓冲液第7页/共22页电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等3.实验器材第8页/共22页1)DNA的准备基因组DNA质粒DNADNA片断4.实验方法和步骤

第9页/共22页2)琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备：称取0.7g琼脂糖，置于三角瓶中。第10页/共22页

加入100mlTBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。第11页/共22页3）胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。

第12页/共22页

将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。第13页/共22页

室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。第14页/共22页4）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20l。第15页/共22页1kbDNAladder（marker）:在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6l的1kbDNAladder（10ng/l）。第16页/共22页5）电泳（带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在80～100V的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳；将凝胶放入溴化乙啶（EB〕工作液（0.5g/ml左右）中染色约20min。第17页/共22页

为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。第18页/共22页6）观察与拍照在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。第19页/共22页第20页/共22页TransportproteinsandsalttoleranceinplantsPlantScience164(2003)891_/900

M.M.F.Mansour,,K.H.A.Salama,M.M.Al-Mutawa

Evidenceindicatesthatplantsalttoleranceoperatesatacellularlevel.Commonlyproposedcellularmechanismsincludeionsequestrationinvacuolesorionexclusionatplasmamembranes.PlasmamembraneATPaseandvacuolarATPaseandpyrophosphataseareprotonpumpsthatprovideanenergysourcefortransportofionsacrosstheplasmamembraneandtonoplast,respectively.MembraneNa+/H+antiporterstakeadvantageoftheprotongradientformedbythesepumpstoexchangeNa+/forH+acrossamembrane.Therefore,activityandexpressionoftheseprotonpumpsandNa+/H+antiportersareinvestigatedinnumerousplantspeciesundersalineenvironment.Inthisreview,informationispresentedonresponsesoftonoplastandplasmamembraneATPasesandNa+/H+antiporterstosalinity.Inconsistenciesexistinsomeoftheinformationandthismaybeduetodifferencesincultivars,experimentalconditions,saltlevelusedandplantage.Correlationbetweenincreasedactivityandexpressionofthesetransportproteinsandadaptationtosalinityisproposed,althoughthiscorrelationisbasedonuntestedhypotheses.Thisprecludesageneralconclusiontobedrawnco