分子生物学课件-第十一章

分子生物学课件-第十一章第1页/共46页基因组是生物体内遗传信息的集合，是生物有机体的单倍体细胞中的所有DNA，包括细胞核内的DNA和各种细胞器中的DNA。基因组学是美国人T·H·Rodehck在1986年7月造出来的。基因组学（genomics）是指研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息的学科。

基因组计划（GenomeProject）是指对人类以及其它生物体全基因组的测序工作(sequencing)。

人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）：90年代提出并已基本完成，第2页/共46页20世纪人类科技发展史上的三大创举

90年代人类基因组计划40年代第一颗原子弹爆炸60年代人类首次登上月球第3页/共46页人类基因组计划高通量DNA序列分析技术Contents第4页/共46页诺贝尔奖获得者RenatoDulbecco（杜伯克）1986年发表于《Science（科学）》杂志的短文《肿瘤研究的转折点：人类基因组测序》中指出：“如果我们想更多地了解肿瘤，我们从现在起必须关注细胞的基因组。……

从哪个物种着手努力？如果我们想理解人类肿瘤，那就应从人类开始…

…

。人类肿瘤研究将因对DNA的详细知识而得到巨大推动。”人类基因组计划第5页/共46页1975年，获诺贝尔生理医学奖 第6页/共46页

美国政府决定于1990年正式启动HGP，预计用15年时间，投入30亿美元，完成HGP。

由国立卫生研究院和能源部共同组成“人类基因组研究所”

逐渐地，HGP扩展为多国协作计划。参与者包括：美、英、日、法、德和中国。作为参与这个计划的唯一的发展中国家，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务虽然参加时间较晚，但是我国科学家提前两年于2001年8月26日绘制完成“中国卷”，赢得了国际科学界的高度评价。。

第7页/共46页最初希望2005年前能够获得人类DNA序列的图谱,但是到1997年,在耗费了巨额资金和一半预定时间之后，多国合作小组仅完成了3%的测序工作。CraigVenter创立了一个名为“CeleraGenomics”的风险投资公司,

并宣称他将在无政府投资条件下早于多国合作小组完成人类基因组计划。第8页/共46页Celera:CraigVenterIntl.Cons:FrancisCollins美国国家人类基因组研究所所长第9页/共46页Publiceffort-strategy:Celera-strategy:SequencingStrategiesCelera’sviewofInternationalConsortiumInternationalConsortium’sviewofCeleraUnfaircompetition:ICdeliveringthesamegoodsbutwithstatefunding.Unfaircompetition:CeleradeliveringthesamegoodsbutcanuseICdata,whileICcannotuseCeleradata.“逐个克隆法”：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装(公共领域测序计划)“全基因组鸟枪法”：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装(美国Celera公司）第10页/共46页

1999年12月英、日、美三国科学家联合完成首条人类染色体（22号染色体）的测序任务第11页/共46页

2000年3月celera公司宣布完成果蝇基因组的测序工作。第12页/共46页CraigVenter开发出新的测序技术”鸟枪测序法”并很快追上了多国合作小组，多国合作小组在美国总统克林顿的撮合下开始与Celera合作。2000.6完成并公布人类基因组工作框架图(90%)。对人类认识自身，提高健康水平，推动生命科学、医学、生物技、制药业、农业等的发展具有极其重要的意义，人类基因组工作草图的完成是该计划实施的一个里程碑，标志着人类在研究自身的过程中迈出其不意关键的一步。有人将此成就与伽利略的天文发现相媲美，有人认为它的意义远远大于抗生素的发明。

第13页/共46页二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成第14页/共46页

2001年2月

人类基因组“精细图”完成(99%)

Celera美国Science,Vol.291,No.5507

多国合作小组英国Nature,Vol.409,p.860

各自独立的同时发表论文,在2001年2月12日的记者招待会上联合宣布人类基因组测序工作的完成。

第15页/共46页人类基因组包括23对染色体，单倍体细胞中约有30亿对核苷酸，编码2万～3万个基因，人类基因组中携带了有关人类个体生长发育、生老病死的全部遗传信息。从整体上看，不同人类个体的基因是相同的，人类99．9％的基因密码是相同的，而差异不到0．1％，因此，我们说“人类只有一个基因组”，人生来是平等的。不同的人可能拥有不同的等位基因，这一点决定了人与人之间个体上的差异。

２００３年４月１４日，人类基因组序列图亦称“完成图”（99.99%），提前绘制成功。

第16页/共46页人类基因组研究的惊人发现•

19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少•目前已经发现和定位了26000多个功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能•人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有“无用DNA”

——不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有1／4的区域没有基因的片段。

•

35．3％的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为是“垃圾”的DNA也起重要作用，应该被进一步研究。第17页/共46页到2006年底已完成的基因组项目（/）

根据2007年1月的数据，全球已启动2296个基因组项目，其中607个项目已经完成，已经公开发表481个基因组序列，包括403个细菌基因组，33个古细菌基因组和45个真核生物基因组。p436其它基因组计划第18页/共46页三、人类基因组计划的科学意义p424（1）确定人类基因组中约3万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。第19页/共46页（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。

（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。第20页/共46页（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。第21页/共46页（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。

第22页/共46页（8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。第23页/共46页以人类基因组和拟南芥基因组为例说明你对生物基因组全序测定工作的科学意义与社会意义的认识（8分）中国科学院2002年

硕士学位研究生入学分子遗传学试题第24页/共46页遗传图谱转录图谱0.7cM或kb

序列图谱物理图谱100kbSTSmap四张图：物理图、转录图遗传图、全序列图

HGP的主要任务第25页/共46页全序列图人类基因组的核苷酸序列图是分子水平上最高层次、最详尽的物理图。测定总长约1米、由30亿个核苷酸组成的全序列是人类基因组计划中最明确、最艰巨的任务。第26页/共46页人类基因组计划高通量DNA序列分析技术Contents第27页/共46页Sanger双脱氧链终止法

基本原理:

DNA聚合酶的双脱氧链终止原理⑴DNA聚合酶能以单链DNA为模板，合成出准确的DNA互补链序列；⑵如果以ddNTP（p417）为底物，掺入到新合成的寡核苷酸链的3‘端后，DNA链的延伸被终止，形成长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基）⑶电泳分离长短不一的核酸片段，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。第28页/共46页技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶

4种脱氧核苷酸在4个试管中分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓

ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基p417第29页/共46页反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。第30页/共46页改进的Sanger法基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光染料标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.第31页/共46页Sangersequencing13maybe800bplong42第32页/共46页DNA测序技术经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1kb的DNA片段进行测序了。第33页/共46页2基因组DNA大片段文库的构建YAC（yeastartificialchromosome,酵母人工染色体）：含有三种必需成分：着丝粒、端粒和复制起点。是迄今容量最大的克隆载体，插入片段平均长度为200-1000Kbp，最大的可以达到2Mbp。第34页/共46页BAC（Bacterialartificialchromosome），用细菌的F质粒及其调控基因构建了细菌染色体克隆载体，其克隆能力在125~150Kbp左右。以BAC为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化，已被科学界广泛接受。125-150Kbpinsertion第35页/共46页Publiceffort-strategy:Celera-strategy:SequencingStrategiesCelera’sviewofInternationalConsortiumInternationalConsortium’sviewofCeleraUnfaircompetition:ICdeliveringthesamegoodsbutwithstatefunding.Unfaircompetition:CeleradeliveringthesamegoodsbutcanuseICdata,whileICcannotuseCeleradata.“逐个克隆法”：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装(公共领域测序计划)“全基因组鸟枪法”：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装(美国Celera公司）第36页/共46页3.鸟枪法序列测定技术及其改良鸟枪法”由美国塞莱拉遗传公司创始人克雷格·文特尔发明。DNA的鸟枪法测序的主要步骤一、建立高度随机、插入片段大小为1-2kb左右的基因组文库。二、高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序；三、用计算机程序进行序列拼接。四、填补缺口。第37页/共46页DNAtargetsampleSHEAR&SIZEe.g.,1Kbp±8%std.dev.EndReads/MatePairsCLONE&ENDSEQUENCE590bp1,000bpMate-PairShotgunDNASequencing每次测序都是在染色体DNA中随机取一小段，因此，把这些随机的小片段按原样拼接成完整的DNA序列就成为基因组序列分析中最关键的问题。第38页/共46页大规模DNA序列拼接

DNA序列拼接问题与组合数学中的最短超串问题相似。最短超串问题即给定一个字符串的集合，找出一最短的字符串称为超串，并将集合中的任何一元素作为其子串。PopularAssemblersTIGRAssembler(TIGR)Phrap(WashU)CeleraAssembler(Celera,TIGR)Arachne(MITBroad)Phusion(Sanger–usesPhrap)Atlas(BaylorHGSC)第39页/共46页AssemblyoftheIndividualSequencesIndividualsequencingreadsarecomparedtoeachotherandwheretheyoverlapcanbeassembledtocreatecontigs（片段重叠群）第40页/共46页AssemblyoftheIndividualSequencesKeepadding