分子生物实验技术

分子生物实验技术第1页/共106页一、DNA提取原理和方法

核酸的理化性质：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。第2页/共106页DNA提取原理

天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。第3页/共106页步骤1、细胞破碎三种方法机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法；

化学试剂法：SDS处理；

酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。第4页/共106页DNA提取的几种方法

(1)浓盐法：A.利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。B.用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。A/B两种方法比较,B法使核酸降解可能少一些。第5页/共106页C.以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5MNaCl，0.015M柠檬酸钠（并称SSC溶液）提取DNA。第6页/共106页（2）阴离子去污剂法

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。第7页/共106页（3）苯酚抽提法

苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA

的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。第8页/共106页（4）水抽提法

利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。第9页/共106页环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微孔滤膜剪碎，用于提取DNA土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处理去除一部分干扰物质后再提取具体方法很多：直接提取法、间接提取法第10页/共106页1、水样DNA提取用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE充分震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1mlTE，加20ul20mg/ml溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加1/3体积5MNaCl，剧烈震荡混匀，12000rpm离心5min，上清液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加1/10V3MpH5.2NaAc后，2.5V无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤后溶于50ulTE中，测定A260/A280，A260/A230确定DNA的纯度和浓度A260/A280:是衡量蛋白质污染程度的指标，通常在1.7-1.8之间较好；A260/A230：衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在1.7-2.0之间较好。第11页/共106页常用试剂盒品牌MPBio公司Fast-PrepSPINKit（forsoil）MoBio公司ultracleansoilDNAkitpowercleansoilDNAkitQiagen公司：QIAampDNAStoolMiniKitOmiga公司国产试剂盒按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20℃保存备用第12页/共106页Fast-PrepSPINKit（forsoil）

操作说明1、称量500mg土样（离心适量活性污泥）到一个LysingMatrixE管中，冰上静置2min。2、加978ul的sodiumphosphatebuffer到样品管中3、加122ulMTbuffer(保持管中有250~500ul剩余空间）4、在振荡器中充分振荡混匀5、13000rpm离心10min6、将上清液转入到一个新的无菌2ml离心管中，加250ulPPS(蛋白质沉淀剂），手动混合10次7、13000rpm离心5min，将上清液转入到一个无菌15ml离心管中（可用10ml管代替）8、摇匀BindingMatrixsuspension，加1ml到15ml管的上清液中第13页/共106页9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化合物10、小心的弃去700ul的上清液11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到SpinTMFilter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再将剩余的混合物加入到SpinTMFilter中，如前操作12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si化合物13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次）14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新的无菌离心管中15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTMFilter16、小心的加入50~100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合物湿润，55℃温浴5min17、13000rpm离心1min，弃去SpinTMFilter，液体保存备用第14页/共106页电泳检测第15页/共106页二、PCR扩增聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）：是一项在体外、短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。第16页/共106页KaryB.MullisPCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第17页/共106页引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年第18页/共106页94℃变性50-65℃退火XX℃延伸第19页/共106页72℃94℃55℃PCR循环第20页/共106页1、PCR技术的原理PCR的原理：以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。第21页/共106页PCR的三个基本步骤(1)

变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50~60℃)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。第22页/共106页PCR原理变性(denaturatation)退火(annealing)延伸(extension)第23页/共106页2、PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）第24页/共106页标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各50～200umol/L

引物10～100pmol/L

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶0.5～2.5U

Mg2+1.5mmol/L

加灭菌的双或三蒸水至100ul第25页/共106页1）引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增每条引物浓度一般

10~100pmol/L,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会第26页/共106页2）酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5U/50l酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少第27页/共106页3）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系dNTP溶液呈酸性，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解，保存不当易变性失活。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度取决于扩增片段的长度，注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔）浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低第28页/共106页

单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。

DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。4）模板第29页/共106页5）Mg2+浓度Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第30页/共106页3、PCR反应条件的选择

PCR反应条件:温度时间循环次数第31页/共106页1）温度与时间的设置：设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸第32页/共106页①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败第33页/共106页

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想第34页/共106页引物的复性温度

通过以下公式帮助选择合适的退火温度：Tm值（融解温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合增加温度能提高PCR反应的特异性;降低温度可增加反应的灵敏性。第35页/共106页③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行一般72℃时，TaqDNA聚合酶每分钟可以合成1000bp左右第36页/共106页③延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些第37页/共106页④循环次数循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多一般选在30～40次之间循环次数决定PCR扩增程度循环次数的多少：主要取决于模板DNA的浓度

次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加第38页/共106页4、PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍第39页/共106页2）特异性强引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。

引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。第40页/共106页引物设计的基本原则引物长度：一般15-30bp，常用18-27bp，有效长度不能大于38bp产物长度：一般100~600bp，最长可达10KB序列Tm值：一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.

G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%

引物自身：引物间无3’端互补、二聚体或发夹结构引物3’端：最末及倒数第二个碱基要求严格配对引物特异性：应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性第41页/共106页PCR反应的特异性决定因素引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性

第42页/共106页常用引物设计软件Primer5generunnerDNAstarOligo第43页/共106页3）简便、快速

PCR扩增法只需要数小时，就可以用电泳法检出基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

4）对标本的纯度要求低不需分离病毒、细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板第44页/共106页1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究

PCR的类型第45页/共106页

高浓度引物低浓度引物第46页/共106页2)反向PCR(reversePCR)

用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。未知序列未知序列已知序列第47页/共106页已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶第48页/共106页电泳引物123412343）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。第49页/共106页4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分第50页/共106页标记引物ＰＣＲ观察PCR产物第51页/共106页5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增第52页/共106页cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC第53页/共106页6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作第54页/共106页7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。第55页/共106页操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达第56页/共106页8）ＲＴ-ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增第57页/共106页9)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。第58页/共106页三、核酸凝胶电泳

核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动速率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。第59页/共106页影响核酸电泳的因素：1．核酸的性质2．凝胶孔径的大小3．电场强度和电场方向4．电泳环境：缓冲液的组成和离子强度第60页/共106页核酸电泳的指示剂：

核酸电泳常用的指示剂有两种：⑴溴酚蓝⑵二甲苯青均带有负电荷，电泳方向与核酸相同，从而指示核酸的位置，其中溴酚蓝泳动速度较快，二甲苯青较慢。第61页/共106页常用核酸凝胶电泳

琼脂糖电泳丙烯酰胺凝胶电泳：变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)第62页/共106页1、琼脂糖电泳

原理：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254～365nm紫外光照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA（此法可观察到凝胶中2ng的DNA）。如有必要可从凝胶中回收DNA片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶（浓度越大凝胶孔径越小），分离DNA的范围广，约200bp～50kb。第63页/共106页2、变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。第64页/共106页双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。原理第65页/共106页不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。第66页/共106页DNA片段在DGGE胶中的迁移行为第67页/共106页在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（一般30-50个碱基对），使DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers,1985).GC夹子第68页/共106页当用DGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerasechainreaction）扩增技术，用PCR扩增的16SrRNA产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16SrRNA基因（16SrDNA）中比较保守的碱基序列设计通用引物，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE分析。由于DGGE一般只能分析500bp以下的DNA片断，所以一般选择扩增16SrRNA基因的V3区（Muyzer,1993），或V6-V8区（Zoetendal,1998）。第69页/共106页DGGE的两种电泳形式垂直电泳：确定变性剂梯度水平电泳：对比分析不同样品的微生物差异第70页/共106页垂直电泳——确定变性剂梯度垂直胶第71页/共106页垂直电泳时，胶从左到右是变性梯度（如上），在胶的左边，变性剂浓度低，DNA片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的右边，由于变性剂浓度高，DNA一进入胶立刻发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA片段有不同程度的解链。在变性剂浓度临界于DNA片段最低解链区域时，DNA的迁移率有急剧的变化。因此，DNA片段在垂直胶电泳染色后呈S形曲线。第72页/共106页水平电泳时间优化确定电泳所需的时间：一般采用时间间歇的方法，即每隔一小时加一次样品，从而使样品的电泳时间有个梯度，根据结果，确定最佳的电泳时间。第73页/共106页染色方法溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）SYBRGreenISYBRGold银染法：单、双链均能染色，灵敏度最高，缺点是DNA不能用于后续分析染色双链第74页/共106页DGGE的应用环境样品（土壤、水、活性污泥等）中细菌、古细菌、真菌、真核微生物的多样性分析（无需培养，直接提取DNA扩增检测）；动、植物体内外共生微生物的检测；食品微生物的检测；医学领域碱基突变的检测；杂合子检测等等。第75页/共106页微生物多样性分析实验流程环境样品DNA的提取→PCR扩增→变性梯度凝胶电泳→指纹图谱带型分析→特征条带的克隆测序第76页/共106页DGGE技术的缺陷1、DNA提取和纯化时会有偏差2、PCR扩增过程会产生偏差3、不同细菌的基因组大小和rDNA的拷贝数不同4、DGGE一般只能分析500bp以下的DNA片段，因此得到的系统进化相关信息少5、相同的样品，不同的电泳条件得到的图谱会有所差异6、单一的DGGE条带可能含有不止一种DNA序列7、PCR过程中产生的异源双链和单链DNA会对分析单一条带序列造成偏差第77页/共106页四、定量PCR

以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。第78页/共106页实时荧光定量PCR(RealtimePCR)

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBisystems公司推出。与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产物污染，自动化程度高，同时对模板进行准确定量等待点；敏感性通常达100拷贝/ml，且线性范围宽；重复性好，

RealtimePCR的结果相当稳定，同一标本的荧光量虽然却相差甚大，但CT值相同，定量也即根据CT值来确定。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

第79页/共106页实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。常规PCR:对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析第80页/共106页三个概念扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件第81页/共106页荧光阈值（threshold）阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。第82页/共106页Ct值（Cyclethreshold）RealTimePCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。(C-代表Cycle，t-代表threshold）第83页/共106页Ct值的重现性

同一个样品重复96次PCR的扩增曲线Ct值Ct值的特点：不同仪器、相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性第84页/共106页定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率第85页/共106页定量PCR定量原理——绝对定量在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程。确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量第86页/共106页RealTimePCR检测方法荧光染料嵌合法(SYBRGreenI、PicoGreen)

荧光探针法

TaqManprobeCyclingprobeMolecularBeaconprobeHybridizationprobeScorpionsprobeAmplifluorprobe第87页/共106页荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色光激发波长的染料。SYBRGreenI第88页/共106页荧光染料嵌合法(SYBRGreenI)作用机理示意图第89页/共106页SYBRGreen法优缺点

对DNA模板没有选择性

----适用于任何DNA

使用方便

-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点第90页/共106页TaqMan探针为一寡核苷酸，

5’端标记一个报告荧光基团(Reporter)，

3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。TaqManProbe法作用机理5’3’第91页/共106页TaqManProbe法作用机理示意图热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRRTaq酶需要有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针第92页/共106页TaqMan法优缺点

对目标序列的高特异性

------阴性结果确定设计相对简单

------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点第93页/共106页SYBRGreenI法vsProbe法

SYBRGreenI法

◆优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。◆缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCR。

Probe法◆优点：特异性强，能进行多重PCR。◆缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。以前对PCR引物的选择、PCR试剂的优化经验不足，Probe法较为广用。第94页/共106页目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=>对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物RealTimePCR引物及探针设计第95页/共106页扩增片段大小★80-150bp(尽量限制在300bp以内)Primer长度★17-25baseGC含量★40-60%(最好45-55%)Tm值★★★两条引物的Tm值尽量接近，引用专用软件计算Tm值序列★

整体上碱基不能过偏个别部分避免GCrich或