分子诊断学遗传性疾病的分子诊断

分子诊断学遗传性疾病的分子诊断第1页/共58页Therearemanydifferenttechniquesthatcanbeusedtodiagnosetheglobingenemutations,includinggap-PCR,ARMS-PCR,andREanalysisofamplifiedproduct.globin：球蛋白KeyPoints第2页/共58页HemophiliaisacongenitaldiseaseofthecoagulationdisorderswhichconstituterecessivedisorderslinkedtochromosomeX.ThestudywascarriedoutbytheSSCP,RELP,Southernblot,VNTR,andSTR.

hemophilia：血友病；congenitaldisease：先天性疾病；coagulation：凝固，凝结；recessive：隐性第3页/共58页TwomultiplexPCRsareconstructedinwhich9exonscanbeamplifiedsimultaneously,and98%ofalldeletionscanbeidentified.multiplex：多样化；exon：外显子；simultaneously：同时地；deletion：缺失第4页/共58页Phenylketonuriaisaninbornerrorofmetabolismresultingfromadeficiencyofphenylalaninehydroxylase.Therearemanytechniquesthatcanbeusedtomutationscreening,suchasPCR-STR,PCR-SSCP,PCR-RFLP,PCR-DGCE,andsoon.

Phenylketonuria：苯丙酮尿phenylalaninehydroxylase：苯基丙氨酸羟化酶第5页/共58页Cysticfibrosis(CF)iscausedbymutationsintheCFTRgene.Fivetestsaremostfrequentlyused:resctrictionenzymeanalysis,theheteroduplexanalysis,ARMS,reversehybridizationandOLA.Cysticfibrosis：囊胞性纤维症heteroduplex：异源双链核酸分子Hybridization：杂交第6页/共58页Huntington’sdisease(HD)involvesapolymorphic(CAG)repeatsequencelocatedinexon1oftheIT15geneat4p16.3.HDcanbeaccuratelyconfirmedorexcludedbyPCR-basedassay.Huntington’sdisease(HD)：亨廷顿病第7页/共58页FragileXdiseaseresultsfromtrinucleotide(CGG)repeatexpansions.Atpresent,diagnosticproceduresoffragileXdiseasearebasedonSouthernblottingandonPCRamplification.

FragileXdisease：脆性X综合征trinucleotide：三核苷酸第8页/共58页TwomajortechnologiesareinuseforPNDandPGD:PCRformonogenicdiseasesandFISHforchromosomalaberrations.

monogenic：单基因的第9页/共58页遗传性疾病的分子诊断（moleculardiagnosisofgeneticdisease）是指通过分析患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，对人体健康状态和疾病做出或辅助诊断的方法。第10页/共58页评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料评估基因的表达量则以基因转录或翻译RNA/蛋白质为对象第11页/共58页Section1遗传性疾病分子诊断的策略所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关。基因突变的概念：遗传物质的各种遗传性改变称基因突变（mutation），其实质是核苷酸的增添、缺失、替代、颠倒和转位。第12页/共58页自然条件自发突变人为干预诱发突变携带突变的生物个体或群体称为突变体（mutant）对遗传性疾病的分子诊断有三种策略可供选择：1.直接诊断策略；2.基因多态性连锁分析；3.基因突变的定量第13页/共58页直接诊断策略通过分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变。因此其前提是被测基因已经被克隆，其核酸序列和机构已被阐明。点突变的诊断：即DNA分子中的一个碱基被另一个碱基所替换，其后果取决于替换的性质和位置第14页/共58页点突变背景清楚或部分清楚：allelespecificoligonucleotide,ASO、PCR-ELISA、allelespecificamplification,ASA、PCR-RFLP、基因芯片点突变背景未知：single-strandconformationalpolymorphism,SSCP、denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE、heteroduplexanalysis,HA、DNA序列测定、proteintruncationtest,PTT第15页/共58页片段性突变的检测：指DNA分子中较大范围的碱基发生突变方法：Southernblotting、多重PCR第16页/共58页基因多态性连锁分析间接诊断，在家系中进行连锁分析和关联分析单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）,第3代遗传标记第17页/共58页第18页/共58页基因突变的定量诊断第19页/共58页Section2遗传病的分子诊断血红蛋白病血红蛋白病（hemoglobinopathy,Hb）是由于编码血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血病。第20页/共58页主要分为两大类：异常血红蛋白病，Hb发生结构上的异常，导致贫血病，例如镰刀状细胞贫血第21页/共58页地中海贫血，构成Hb的蛋白部分-珠蛋白的合成降低或消失，也称珠蛋白合成障碍性贫血第22页/共58页第23页/共58页α珠蛋白基因&β珠蛋白基因第24页/共58页镰刀状细胞贫血（sicklecellanemia）镰刀状细胞贫血的分子机制第一个成功在分子水平得以解释的人类疾病第25页/共58页第26页/共58页镰刀状细胞贫血的分子诊断方法最常用的是限制性内切酶法（RE）第27页/共58页地中海贫血（thalassemia）由于珠蛋白基因缺失或突变导致某种珠蛋白链合成速率降低，造成α链和非α链合成不均衡，引起溶血性贫血。按照合成速率降低的珠蛋白类型分为α、β、γ、δ地中海贫血第28页/共58页α-地中海贫血（α-thalassemia）α0地贫是α链完全不能合成者α+地贫是部分α链合成者HbBartˊs水肿综合征HbF为α2γ

2α链减少形成γ

4聚体HbH病HbA为α2β2α链减少,形成β4聚体具有较高的氧的亲合力，使组织供氧不足导致贫血第29页/共58页α地中海贫血的分子机制缺失型α+地贫α0地贫1）α+地贫：左侧缺失：α2基因右侧缺失：α2基因3ˊ端和α1基因5ˊ端构成融合基因第30页/共58页2)α0地贫①缺失α珠蛋白到α1基因5ˊ端缺25kb②只有ζ基因缺17.4kb

③ζ和Ψζ基因缺17.5kb

④

缺失α2基因和α1基因5ˊ端缺5.2kb第31页/共58页第32页/共58页3）非缺失型α地贫中国人非缺失型HbH病病因：α2基因的125位密码子CTG（亮）突变CCG（脯),妨碍α1β1二聚体的形成，导致贫血分子诊断方法PCR法、ARMS法、ASA法、SSCP法、等位基因特异性扩增技术（ASPCR）法

第33页/共58页1）重型β地中海贫血：β0/β0

和β0/β+β链合成减少，γ链合成增加，HbF对氧亲和力高，是组织缺氧2）轻型β地中海贫血：β0/βA

和β+/βA3）δβ地中海贫血：β和δ基因缺失导致β链、δ链不能合成β地中海贫血是β珠蛋白基因突变和部分缺失导致β链合成速率降低。第34页/共58页β地中海贫血的分子诊断方法PCR-RDB法、PCR-ASO法、ASPCR法、突变寡核苷酸延伸扩增PCR（mutantoligonucleotideextentionamplification,MOEA）法、多重等位基因特异PCR（multiplexallelespecificPCR，MAS-PCR）法、基因芯片法第35页/共58页血友病（hemophilia）多数凝血因子是蛋白质，由其有关的基因编码。由于这些基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺失即造成血友病第36页/共58页甲型血友病概念：抗血友病球蛋白（antihemophilicglobulin,AHG)遗传性缺乏所致临床表现：出血不止分子基础：FⅧ

由26个外显子（9kb）25个内含子（177kb）编码2351个氨基酸第37页/共58页第38页/共58页分子诊断方法：基因倒位检测和非基因倒位检测基因倒位检测：LD-PCR（长距离PCR）非基因倒位检测：PCR-RFLP法、VNTR法、STR法、PCR-SSCP法第39页/共58页乙型血友病概念：凝血因子Ⅸ

即血浆凝血活成分（PTC）遗传性缺乏临床表现：出血部位：肌肉、关节、深部组织分子基础：FⅨ，长度34kb，8个外显子和7个内含子以及侧翼顺序中调控区域构成第40页/共58页分子诊断方法：直接和间接方法检测直接检测方法：直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳间接检测方法：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱法第41页/共58页肌营养不良症（hemophilia）主要有杜氏肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy,DMD）和贝氏营养不良症（Beckermusculardystrophy,BMD）发病机制：抗肌萎缩蛋白基因的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白发生结构和功能的改变所致第42页/共58页第43页/共58页抗肌萎缩蛋白基因：DMD基因包括79个外显子和78个内含子，全长约2.3×106bp，是目前已知人类最大的基因分子诊断方法：多重PCR技术第44页/共58页第45页/共58页短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）连锁分析定量PCR技术RT-PCR技术第46页/共58页苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病临床表现：智力障碍、色素减少、尿特殊气味及神经和精神症状第47页/共58页第48页/共58页分子诊断方法：PCR-STR连锁分析PCR-RFLP多重ASPCR法PCR-DGGE法第49页/共58页囊性纤维化（cysticfibrosis,CF）由囊性纤维化穿膜传导调节因子（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR）基因突变所致临床表现：极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数患者仅能成活数年到10余年第50页/共58页第51页/共58页分子诊断方法：PCR-SSCP法HA法A